样本收集与MeDIP-seq检测
获取ENKTL、nodal-TNKL、细胞系和对照的DNA甲基化图谱
从FFPE样本提取DNA，片段化后建库，进行甲基化DNA免疫沉淀，扩增并测序。
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DNA甲基化特征区分结外NK/T细胞淋巴瘤与EBV阳性结内T/NK细胞淋巴瘤并识别预后亚组
DNA methylation signatures distinguish extranodal NK/T-cell lymphoma and EBV-positive nodal T/NK-cell lymphoma and identify prognostic subgroups
实验完整度
高FFPE样本MeDIP-seq，含细胞系和对照；整合表达数据、CNV和LOH分析及生存分析
主要模型
ENKTL患者FFPE样本 nodal-TNKL患者FFPE样本 ENKTL细胞系 对照组织（扁桃体、淋巴结、鼻黏膜、原代T/NK细胞）
重点核对
样本类型与数量：ENKTL 43例（来自39例患者）、nodal-TNKL 12例、ENKTL细胞系5例、对照28例 MeDIP-seq数据分析阈值：DMRs筛选为adjusted p ≤ 0.01且|log2FC| ≥ 1.5（部分分析阈值不同） ENKTL亚组划分：基于无监督层次聚类，分为ENKTL-group 1和2 生存分析：Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型，比较两组总生存 拷贝数分析：OncoScan FFPE assay，GISTIC分析，计算LOH、GI和HRD评分
摘要
结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）与原发EBV阳性结内T/NK细胞淋巴瘤（nodal-TNKL）是侵袭性淋巴瘤，临床病理特征重叠但生物学基础不同。尽管其基因组图谱日益明确，比较表观遗传学特征仍有限。我们对ENKTL、nodal-TNKL、ENKTL细胞系和对照组织的福尔马林固定石蜡包埋样本进行了甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）。ENKTL显示广泛的启动子高甲基化，与肿瘤抑制基因、谱系调控因子和淋巴信号基因（包括LEF1和BANK1）的抑制相关，同时免疫和干扰素应答基因（如IFITM1）存在局灶性低甲基化。相反，nodal-TNKL显示整体低甲基化，尤其影响细胞毒性、免疫应答和抗原呈递通路；TET2突变的nodal-TNKL病例表现出位点特异性甲基化改变。在所有样本中，整体DNA甲基化水平与基因组不稳定性相关。无监督聚类识别出两个表观遗传学上不同的ENKTL亚组，其中一个以更高的整体甲基化、TP53缺失、增加的拷贝数改变和杂合性缺失以及显著更差的总生存为特征。总之，本研究定义了ENKTL和nodal-TNKL之间的基本表观遗传差异，并将DNA甲基化动态与基因组不稳定性和临床结局联系起来，突出了甲基化谱分析在精细分类、风险分层和治疗指导中的价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ENKTL与EBV阳性nodal-TNKL之间的DNA甲基化图谱有何差异，以及ENKTL内部是否存在表观遗传学亚组并与临床结局相关？
- 核心机制
- ENKTL以启动子高甲基化介导的肿瘤抑制基因、谱系调控因子和淋巴信号基因（如LEF1、BANK1）抑制为特征，而nodal-TNKL表现为整体低甲基化富集免疫激活和抗原呈递通路；DNA甲基化水平与基因组不稳定性相关，高甲基化ENKTL亚组伴有TP53缺失、高CNA/LOH和不良生存。
- 主要证据
- 对ENKTL、nodal-TNKL、ENKTL细胞系和对照FFPE样本进行MeDIP-seq，鉴定差异甲基化区域；整合基因表达微阵列数据验证甲基化与表达负相关；利用OncoScan拷贝数数据计算CNA、LOH和GI；无监督聚类和生存分析关联ENKTL亚组与预后。
- 研究意义
- 研究定义了ENKTL和nodal-TNKL之间根本不同的表观遗传学架构，识别了ENKTL的预后相关甲基化亚组，提示甲基化谱分析可用于精细分类、风险分层和治疗指导。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异甲基化区域鉴定与聚类分析
比较ENKTL、nodal-TNKL与对照之间的甲基化差异，并探索ENKTL内部异质性
使用QSEA分析MeDIP-seq数据，鉴定DMRs，进行PCA和层次聚类，注释DMRs至基因组区域和基因。
甲基化与基因表达关联分析
评估启动子甲基化对基因表达的功能影响
将启动子甲基化数据与基因表达微阵列数据（Clariom D）进行相关性分析，筛选甲基化与表达负相关的基因，并与公共单细胞RNA-seq数据验证。
ENKTL亚组临床和基因组特征关联
探究ENKTL甲基化亚组是否与临床变量、基因组不稳定性及生存相关
比较两个ENKTL亚组的临床病理变量、总体生存，以及拷贝数改变、杂合性缺失和基因组不稳定性评分。
TET2突变相关甲基化分析
探讨TET2突变对nodal-TNKL甲基化模式的影响
比较TET2 mut⁺和TET2 mut⁻ nodal-TNKL病例的差异甲基化区域，并进行通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| MeDIP-seq文库制备 | NEBNext® Ultra™ II FS DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7805, E6177 |
| DNA纯化 | MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 |
| 甲基化DNA免疫沉淀 | MagMeDIP试剂盒 | Diagenode | -- |
| 抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体（克隆33D3） | -- | -- | |
| 测序 | Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- |
| 基因表达分析 | GeneChip® Clariom D芯片（人） | Affymetrix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与MeDIP-seq | 样本类型和数量：ENKTL 43例（来自39例患者）、nodal-TNKL 12例、ENKTL细胞系5例、对照28例；DNA输入量≥100 ng；测序平台Illumina HiSeq 阅读提示：Methods 'Samples'和'MeDIP-seq library preparation and sequencing'小节；Fig. 1A |
| 差异甲基化分析 | DMRs筛选阈值：ENKTL vs 对照和ENKTL vs nodal-TNKL为adjusted p ≤ 0.01且|log2FC| ≥ 1.5；nodal-TNKL vs 对照为adjusted p ≤ 0.05且|log2FC| ≥ 1；使用QSEA v1.30.0和hg38注释 阅读提示：Methods 'Data and statistical analysis'小节；Fig. 1B-C、Fig. 2A-B、Fig. 5A-B |
| ENKTL亚组生存分析 | 亚组划分基于无监督层次聚类；生存分析使用Kaplan-Meier和Cox比例风险模型；调整变量包括年龄、性别、IPI、分期和治疗类别 阅读提示：Results 'ENKTL stratifies into two epigenetically distinct subgroups with divergent clinical outcomes'；Fig. 4B；Table 1B |
| 拷贝数分析 | 拷贝数数据来自OncoScan FFPE assay；CNA分析使用GISTIC；LOH、GI和HRD评分根据先前发表方法计算 阅读提示：Methods 'Data and statistical analysis'小节；Fig. 4E-G |
| TET2突变相关分析 | TET2 mut⁺ 5例，TET2 mut⁻ 3例；DMRs筛选阈值p < 0.05且|log2FC| > 1 阅读提示：Results 'Widespread hypomethylation in nodal-TNKL underlies enrichment of immune activation pathway'；Fig. 5D-E |