构建并验证DhddsR37H敲入小鼠
建立携带人类反复de novo p.R37H变异的哺乳动物疾病模型并确认基因型分布。
利用CRISPR-Cas9技术构建DhddsR37H C57BL/6敲入小鼠，对杂合互交后代进行基因分型，并检测E8胚胎以评估纯合致死性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
携带单等位p.R37H Dhdds变异的小鼠表现出异常糖基化及中间神经元缺陷
Mice with the mono-allelic p.R37H Dhdds variant show aberrant glycosylation and interneuron deficits
实验完整度
高含基因敲入小鼠模型、脑组织多组学、重组酶活性与结构模拟、电生理及行为学多层级验证
主要模型
DhddsR37H+/−基因敲入C57BL/6小鼠 WT同窝小鼠 重组人cis-PTase复合物（WT与R37H） 小鼠脑微粒体及脑突触体
重点核对
DhddsR37H+/−小鼠脑微粒体cis-PTase活性降至WT的30–40%（每组n=6，3雄3雌） 纯化重组DHDDSR37H酶复合物kcat为0.15±0.01 s−1，WT为0.73±0.01 s−1（各n=3） 脑组织多萜醇/多萜醇类约降低40%，以长链C19-C22种类下降最明显（每组n=10，5雄5雌） PTZ致痫阈值：DhddsR37H+/−为20.1±0.1 mg/kg BW（n=3），WT为35.2±3.5 mg/kg BW（n=4），P=0.005 AZM 40 mg/kg BW腹腔注射、PTZ输注前45分钟，使DhddsR37H+/−小鼠癫痫易感性降低45%（P=0.03，每组n=5–6）
摘要
由DHDDS基因（DHDDS-CDG）杂合致病性变异导致的伴或不伴运动异常的发育迟缓与癫痫（OMIM 617836）是一种罕见的遗传性疾病，属于进行性脑病谱系。患儿表现为认知迟缓，并伴有肌阵挛、癫痫发作、共济失调和震颤，且随时间加重。DHDDS编码DHDDS/NUS1顺式异戊烯基转移酶（cis-PTase）的一个亚基，该酶是甲羟戊酸途径中对N-连接糖基化至关重要的分支点酶。我们描述了该疾病的首个小鼠模型——DhddsR37H+/−品系，其杂合携带人类反复出现的de novo c.110G>A:p.R37H致病性变异。DhddsR37H+/−小鼠表现出癫痫发作、肌阵挛和记忆缺陷，并伴有皮层抑制性中间神经元密度和/或成熟度降低。对小鼠CNS组织进行的多组学分析，结合对R37H DHDDS突变蛋白的酶学/结构表征，揭示该变异产生一种催化失活的酶，并导致脑内多萜醇缺乏、脑糖蛋白（包括参与突触传递的糖蛋白）的异常糖基化，以及CNS蛋白质组和脂质组的重大扰动。乙酰唑胺是一种碳酸酐酶抑制剂，已在临床上获批用于治疗青光眼、癫痫和颅内高压，并被成功“超说明书”用于治疗遗传性运动障碍，它可降低DhddsR37H+/−小鼠对戊四氮的癫痫易感性，提示在人类DHDDS-CDG患者中使用该药物可能具有治疗价值。总之，我们的结果将cis-PTase定义为CNS发育和功能的主调控因子，并证实其单等位致弱变异导致一种与神经元蛋白和脂质水平异常相关的新型先天性糖基化障碍。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 单等位DHDDS p.R37H致病性变异是否导致类似人类DHDDS-CDG的神经发育与癫痫表型，其分子与细胞机制为何？
- 核心机制
- R37H变异损害DHDDS对FPP的配位并使cis-PTase催化失活，导致脑内多萜醇缺乏及脑糖蛋白异常N-糖基化，进而引起GABA能突触缺陷、皮层中间神经元减少/未成熟及兴奋/抑制失衡。
- 主要证据
- DhddsR37H+/−小鼠重现癫痫、肌阵挛与记忆缺陷；脑微粒体酶活性降低、多萜醇减少；重组酶动力学与MD模拟显示FPP配位受损；糖蛋白组与N-糖组显示低糖基化及糖链结构改变；PV+中间神经元及PNN减少，mIPSC幅度降低。
- 研究意义
- 将cis-PTase确立为CNS发育与功能的主调控因子，证明DHDDS单等位致弱变异引起新型I/II型先天性糖基化障碍，并提示AZM可能降低癫痫易感性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测cis-PTase活性及多萜醇合成
验证R37H变异对酶活性及下游多萜醇生成的影响。
测定小鼠脑微粒体cis-PTase活性，表达并纯化重组WT与R37H人cis-PTase复合物进行酶动力学分析，并对FPP结合复合物进行全原子MD模拟；以靶向与非靶向脂质组学检测脑内多萜醇和多萜醇类。
评估癫痫与神经行为表型
判断小鼠是否重现患者癫痫、运动与认知症状。
在P60-P75起进行连续视频-EEG记录（电极植入S1与CA1），以持续静脉输注PTZ评估致痫阈值，并进行加速转棒、Y迷宫和新物体识别测试。
检测皮层中间神经元与抑制性电活动
明确GABA能中间神经元密度/成熟度及局部兴奋-抑制平衡的改变。
对脑切片进行PV、WFA凝集素和aggrecan免疫荧光及共聚焦定量，并在P26–35急性冠状脑切片中对S1第V层主细胞进行电压钳记录sEPSC、sIPSC和mIPSC。
分析脑蛋白N-糖基化改变
确定多萜醇缺乏是否导致脑糖蛋白低糖基化及糖链结构异常。
对脑匀浆胰酶消化富集的糖肽进行LC-MS/MS糖蛋白质组分析，并以MALDI-TOF/TOF分析全脑、脑皮层和血清的N-糖组。
多组学解析CNS病理改变
系统刻画转录组、蛋白质组、突触体蛋白及脂质组成的改变。
对脑组织进行总RNA测序和半定量蛋白质组分析，分离脑突触体后进行非标记LC-MS/MS，并进行非靶向脂质组学与MALDI-MSI，检测硫苷脂及GSL。
评估AZM对癫痫易感性的干预作用
检验AZM是否降低突变小鼠的癫痫易感性。
在PTZ静脉输注前45分钟腹腔注射AZM或生理盐水，比较WT与DhddsR37H+/−小鼠的致痫阈值，并观察转棒成绩。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脂质组学分析 | UPLC-MRT系统 | Waters | -- |
| CSH C18 Acquity Premier色谱柱 | Waters | -- | |
| MALDI成像 | MALDI-MRT系统 | Waters | -- |
| N-糖组分析 | 4800蛋白质组分析仪 | AB Sciex | -- |
| 蛋白质组与糖蛋白质组分析 | Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo | -- |
| Ultimate 3000液相色谱系统 | Thermo | -- | |
| 突触体分离 | 脑突触体分离试剂盒 | Thermo | 87793 |
| 免疫荧光成像 | Leica DM 5500 Q共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 药物处理 | 乙酰唑胺 | -- | -- |
| 癫痫诱导 | 戊四氮 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DhddsR37H敲入小鼠模型 | 遗传背景C57BL/6、CRISPR-Cas9构建方式、杂合互交基因型比例及纯合胚胎致死性 阅读提示：Methods的Animals小节与Supplementary Fig.1 |
| cis-PTase活性与多萜醇检测 | 脑微粒体来源与每组样本量（n=6，3雄3雌）、重组酶表达纯化与动力学参数、多萜醇LC-MS/MS的样本量（n=10） 阅读提示：Methods的DHDDS variant modeling and assays小节及Fig.1B–C、1I–O图注 |
| 视频-EEG与PTZ致痫阈值 | 电极植入位点（S1与CA1）、记录时长（突变组14天、WT 10天）、PTZ浓度与输注速率（10 mg/ml，0.1 ml/min）、每组动物数 阅读提示：Methods的Electrophysiology小节及Fig.2A–E图注 |
| AZM干预 | 剂量40 mg/kg BW、溶剂8% DMSO生理盐水、腹腔注射、PTZ前45分钟给药、每组n=5–6 阅读提示：Methods的Electrophysiology小节及Fig.2F–G图注 |
| 电生理记录 | P26–35急性脑切片、S1第V层主细胞、每组细胞数与小鼠数、mIPSC幅度统计 阅读提示：Results中电生理段落及Fig.3D–F图注 |
| 多组学与糖基化分析 | 各组样本量与性别构成、糖蛋白质组n=6、N-糖组n=4、RNA测序每种基因型3只、MALDI-MSI n=2 阅读提示：Methods的Multiomics analyses小节及Fig.4–7图注 |
| 行为学测试 | Y迷宫、新物体识别与加速转棒的每组样本量（n=7–13）及性别构成 阅读提示：Methods的Behavior analysis小节及Fig.2H–L图注 |