临床样本中Fn丰度与SLC7A11表达相关性分析
验证瘤内Fn丰度是否与SLC7A11表达相关
对TCGA和TCMA数据库进行分析，并对ESCC和BRCA石蜡包埋组织进行qPCR检测Fn丰度和IHC检测SLC7A11表达。
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瘤内具核梭杆菌在葡萄糖限制下促进铁死亡抵抗并暴露二硫化物应激相关脆弱性
Intratumoral Fusobacterium nucleatum promotes ferroptosis resistance and a disulfide-stress-associated vulnerability under glucose restriction
实验完整度
高含体外多种肿瘤细胞系、患者组织样本、动物皮下及原位肿瘤模型和多种功能与机制验证
主要模型
E109和kyse30食管鳞癌细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系 PANC-1胰腺癌细胞系 BALB/c裸鼠E109皮下移植瘤和231原位乳腺脂肪垫肿瘤模型
重点核对
Fn感染复数MOI=10:1，感染24或48小时 Era、RSL3、Fer-1、BAY876等药物浓度及处理时间按细胞系区分 体内Fn注射剂量1×10^6 CFU/鼠及给药途径和时程 Era 10 mg/kg、RSL3 5 mg/kg、BAY876 3 mg/kg腹腔注射每48小时一次 每组动物样本量n=5（生存分析n=8），体外至少三个生物学重复
摘要
具核梭杆菌（Fn）是一种与多种癌症相关的胞内致癌细菌。尽管Fn已被认为与抗癌治疗耐药相关，但其对靶向代谢性细胞死亡程序的治疗有何影响仍不清楚。在此，我们显示瘤内Fn丰度与SLC7A11表达呈正相关，且Fn感染减弱Era和RSL3诱导的肿瘤细胞铁死亡。活菌与灭活菌对比、供体及药理学证据提示，Fn感染期间产生的H2S参与SLC7A11诱导及下游GSH/GPX4轴的激活。Fn感染还减少脂质过氧化物和Fe2⁺积累，并伴随ACSL4下调和FTH1上调。Fn感染细胞显示葡萄糖摄取增加和对葡萄糖的依赖性增强。在葡萄糖充足条件下，Fn感染细胞对铁死亡相对抵抗，而葡萄糖剥夺则暴露一种伴随二硫化物应激的条件性脆弱性。RSL3进一步使Fn感染细胞对葡萄糖限制敏感，且GPX4抑制与GLUT1抑制剂BAY876联合在Fn感染的实体瘤模型中增强抗肿瘤活性。这些发现确定了与Fn感染相关的营养依赖性代谢弱点，并支持在适当对照的模型中进一步评估联合抑制葡萄糖转运和GPX4的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 瘤内Fn丰度是否与SLC7A11表达相关，以及Fn感染产生的H2S是否通过SLC7A11/GSH/GPX4轴影响肿瘤细胞铁死亡和葡萄糖限制相关的二硫化物应激。
- 核心机制
- Fn感染期间产生的H2S参与诱导SLC7A11及下游GSH/GPX4轴，同时伴随ACSL4下调和FTH1上调，共同促进铁死亡抵抗；在葡萄糖限制下，持续的胱氨酸摄取导致NADPH消耗和二硫化物应激，形成条件性脆弱性，但未证实H2S与SLC7A11的直接分子机制。
- 主要证据
- 人肿瘤组织中Fn丰度与SLC7A11表达正相关；多种肿瘤细胞系中Fn感染增加SLC7A11/GPX4表达并减弱Era/RSL3诱导的铁死亡；活菌与灭活菌对比、NaHS供体和Ga抑制实验支持H2S贡献；动物模型中Fn感染减弱Era/RSL3抗肿瘤效果，BAY876联合RSL3增强抗肿瘤活性。
- 研究意义
- 确定了与Fn感染相关的营养依赖性代谢弱点，支持在适当对照的模型中进一步评估联合抑制葡萄糖转运和GPX4的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Fn感染对SLC7A11/GSH/GPX4轴的影响及H2S贡献验证
验证Fn感染是否通过H2S诱导SLC7A11/GSH/GPX4轴
在E109、kyse30、231和PANC-1细胞中检测Fn感染后SLC7A11 mRNA和蛋白表达；使用WSP-5探针检测H2S；使用NaHS供体和Ga抑制Fn H2S生成酶；检测胱氨酸摄取、GSH和GPX4表达；使用SLC7A11 siRNA敲低。
Fn感染对Era和RSL3诱导铁死亡的影响及机制验证
验证Fn感染是否减弱铁死亡诱导剂效果及其相关机制
在四种细胞系中检测Fn感染后Era或RSL3处理后的细胞活力、线粒体形态、ROS和脂质过氧化、Fe2+积累、ACSL4和FTH1表达；使用ACSL4过表达和FTH1敲低进行功能验证；在E109皮下移植瘤和231原位肿瘤模型中验证Fn感染对Era/RSL3抗肿瘤效果的影响。
葡萄糖限制下Fn感染细胞的脆弱性及联合治疗评估
验证Fn感染细胞在葡萄糖限制下是否暴露二硫化物应激相关脆弱性，并评估GLUT1抑制联合GPX4抑制的效果
在无葡萄糖培养基中检测Fn感染后SLC7A11/GPX4表达、葡萄糖摄取、细胞活力、F-actin结构、胱氨酸摄取和NADP+/NADPH比值；使用BAY876联合Era或RSL3；在Fn感染肿瘤模型中评估BAY876联合RSL3或Era的抗肿瘤效果；在尾静脉转移模型中评估2-DG联合方案。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 血琼脂平板 | Huankai Microbial | CP0160 |
| 厌氧培养 | 厌氧产气袋 | Mitsubishi Gas Chemical Co. | C-01 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | A1049101 |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 药物处理 | Erastin | Selleck Chemicals | S7242 |
| RSL3 | Selleck Chemicals | S8155 | |
| Ferrostatin-1 | Selleck Chemicals | S7243 | |
| BAY876 | Selleck Chemicals | S8452 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MedChemExpress | HY-13966 | |
| Z-VAD-fmk | MedChemExpress | HY-16658B | |
| necrostatin-1 | MedChemExpress | HY-15760 | |
| 没食子酸 | Solarbio | G8720 | |
| RNA提取 | AG RNAex Pro试剂 | Accurate Biology | AG21102 |
| 逆转录 | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11711 |
| DNA提取 | TIANamp FFPE DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP331 |
| qPCR | SYBR Green Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 |
| CFX96实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1载体 | Invitrogen | V79020 |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 |
| 细胞活力检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0017 |
| iMark酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| RNA测序 | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | E7530L |
| 代谢组学 | TSQ Quantum Access MAX三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | 抗SLC7A11/xCT抗体 | ABclonal | A13685 |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Ray Antibody | RM2007 | |
| FV3000激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 免疫组化 | 抗SLC7A11抗体 | Abcam | ab307601 |
| 抗GPX4抗体 | Servicebio | GB120010 | |
| DAB显色试剂盒 | CWBIO | CW0125S | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 抗GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 抗ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| 抗FTH1抗体 | ABclonal | A1144 | |
| 抗GAPDH抗体 | Bioworld | AP0063 | |
| ECL化学发光试剂 | NCM Biotech | P10100 | |
| 非还原Western blot | 二硫苏糖醇 | Solarbio | D8220 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Bioworld | AP0060 | |
| F-actin染色 | TraKine F-actin染色试剂盒 | Abbkine Scientific | KTC4009 |
| H2S检测 | WSP-5探针 | Maokang Biotechnology | MX5302 |
| Fe2+检测 | FerroOrange检测试剂盒 | Dojindo Laboratories | F374 |
| 流式分析 | DCFH-DA探针 | Beyotime Biotechnology | S0033M |
| C11-BODIPY 581/591探针 | Invitrogen | D3861 | |
| 2-NBDG探针 | APExBIO | B6035 | |
| CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Colter | -- | |
| NADP+/NADPH检测 | NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8法） | Beyotime Biotechnology | S0179 |
| GSH检测 | 总谷胱甘肽检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S0052 |
| 胱氨酸摄取检测 | 胱氨酸摄取检测试剂盒 | Dojindo Laboratories | UP05 |
| Synergy H1酶标仪 | BioTek Instruments | -- | |
| 细胞内细菌存活检测 | 庆大霉素 | Solarbio | G8170 |
| 透射电镜 | Hitachi HT7800透射电镜系统 | Hitachi | -- |
| 体内Fn定位 | DiD标记的Fn | Beyotime Biotechnology | C1995S |
| 体内成像 | IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 血液学分析 | BC-5000Vet全自动动物血液分析仪 | Mindray | -- |
| 组织病理学 | 伊红 | Servicebio | G1001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Fn感染与细胞处理 | Fn感染复数MOI=10:1；感染时间24或48小时；不同细胞系Era/RSL3浓度不同（见表S4）；Fer-1 1 μM在诱导剂前4小时加入 阅读提示：Materials and methods中Cell culture and compounds小节及Table S4 |
| 临床样本相关性分析 | ESCC 13例和BRCA 9例纳入分析；Fn丰度以ΔCt=−[Ct(Fn)−Ct(18S)]计算；SLC7A11以IHC H-score评估 阅读提示：Results第一部分及Figure 1g图注，Table S1 |
| 动物模型与体内给药 | E109皮下移植瘤每只接种5×10^6细胞；231原位每只接种1×10^6细胞；Fn每只1×10^6 CFU尾静脉注射；Era 10 mg/kg、RSL3 5 mg/kg、BAY876 3 mg/kg腹腔注射每48小时一次；每组n=5 阅读提示：Materials and methods中Animal experiments小节及Figures 4b,j、6a,d治疗时间线 |
| 葡萄糖限制与联合处理 | 无葡萄糖培养基中Era/RSL3浓度按细胞系调整；BAY876 5 μM在Era/RSL3前3小时加入；2-DG 1 g/kg每周一次 阅读提示：Materials and methods中Cell culture and compounds及Animal experiments小节 |
| 统计学分析 | 体外数据为至少三次独立实验的mean±SD；体内肿瘤体积和重量为mean±SEM；正态性用Shapiro-Wilk检验；两组比较用t检验或Mann-Whitney U检验；多组用one-way ANOVA 阅读提示：Materials and methods中Statistical and reproducibility小节 |