构建AHCYL1胰腺腺泡细胞特异性敲除小鼠并诱导AP
验证AHCYL1在AP中的表达变化及其缺陷对炎症反应的影响
采用Cre-loxP系统，人PRSS1启动子驱动Cre，构建AHCYL1 CKO小鼠；用雨蛙肽+LPS或牛磺胆酸诱导AP，检测血清细胞因子、胰腺HE染色和CD68免疫组化
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S-腺苷同型半胱氨酸水解酶样蛋白1缺陷导致急性胰腺炎中更强的炎症反应
S-adenosylhomocysteine hydrolase-like protein 1 deficiency resulted in stronger inflammation reaction in acute pancreatitis
实验完整度
高包含CKO小鼠体内模型、原代腺泡细胞体外实验、巨噬细胞共培养、代谢组学和蛋白质组学等多层证据及功能与机制验证
主要模型
AHCYL1胰腺腺泡细胞特异性CKO小鼠 C57BL/6小鼠AP模型（雨蛙肽+LPS或牛磺胆酸诱导） 原代胰腺腺泡细胞 原代腹腔巨噬细胞
重点核对
AP诱导方式：雨蛙肽+LPS或牛磺胆酸(TA)注射 CKO小鼠构建：Cre-loxP系统，人PRSS1启动子驱动Cre 原代腺泡细胞处理：200 nM雨蛙肽+10 ng/mL LPS作用6 h SSAT抑制剂diminazene aceturate剂量5 mg/Kg腹腔注射 mTOR激活剂3BDO或PGK1抑制剂NG 52浓度10 μM
摘要
背景：急性胰腺炎(AP)的机制尚未完全阐明，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶样蛋白1(AHCYL1)在AP中的作用尚不清楚。方法：本研究构建了AHCYL1胰腺腺泡细胞特异性敲除(CKO)小鼠并诱导AP，在小鼠或原代细胞中研究了相关机制。结果：发现AHCYL1在AP小鼠中降低。CKO导致AP胰腺中巨噬细胞浸润增加。AHCYL1与氨基酸转运体的结合在AP中减少。AHCYL1缺陷时AP中氨基酸摄取、mTOR抑制和MIF产生加重。蛋白质组学中差异表达的PGK1在PPI网络中与mTOR和MIF均相关。发现PGK1在CKO AP胰腺中进一步增加，而mTOR激活剂可逆转这一变化。AP下MIF表达和分泌可被mTOR激活剂或PGK1抑制剂抑制。MIF诱导的巨噬细胞迁移可被mTOR激活剂或PGK1抑制剂减少。CKO AP小鼠血清中N1-乙酰精胺增加。AP下CKO腺泡细胞培养导致N1-乙酰精胺生成酶SSAT进一步增加，而mTOR激活剂或PGK1抑制剂可抑制这一变化。MIF诱导巨噬细胞中SSAT和细胞因子，后者可被SSAT抑制剂减少。最后，AHCYL1与去泛素化酶OTUD6B的结合在AP中减少。OTUD6B敲低导致AHCYL1泛素化及其减少。AHCYL1恢复减少了AP中的细胞因子释放和巨噬细胞浸润。结论：腺泡细胞中的AHCYL1缺陷/氨基酸摄取抑制/mTOR抑制/PGK1上调/MIF分泌轴诱导了AP中巨噬细胞的SSAT和胰腺中巨噬细胞浸润。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AHCYL1在急性胰腺炎中的作用及其调控氨基酸、mTOR和聚胺代谢的机制尚不清楚，本研究旨在探究AHCYL1缺陷对AP的影响及相关调控网络。
- 核心机制
- AP中OTUD6B与AHCYL1解离导致AHCYL1泛素化降解，AHCYL1减少使与SLC7A5/SLC7A8结合下降，氨基酸摄取抑制进而抑制mTOR，mTOR抑制诱导PGK1上调，PGK1促进MIF表达和分泌，MIF诱导巨噬细胞中SSAT上调及巨噬细胞浸润。
- 主要证据
- AHCYL1 CKO小鼠及原代腺泡细胞实验显示AP中AHCYL1降低、巨噬细胞浸润和细胞因子增加；免疫共沉淀和质谱证实AHCYL1与SLC7A5/SLC7A8及OTUD6B结合减少；mTOR激活剂3BDO和PGK1抑制剂NG 52可逆转PGK1、MIF及巨噬细胞迁移变化；SSAT抑制剂diminazene aceturate减少细胞因子和巨噬细胞浸润；AAV或重组AHCYL1恢复减轻AP。
- 研究意义
- 本研究揭示了AHCYL1在AP中调控氨基酸摄取、mTOR/PGK1/MIF轴及巨噬细胞SSAT的机制，提示AHCYL1恢复可减轻AP炎症反应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原代腺泡细胞代谢组学及氨基酸摄取检测
探究AHCYL1缺陷对腺泡细胞分泌代谢物及氨基酸摄取的影响
收集雨蛙肽+LPS处理的原代腺泡细胞培养物进行代谢组学分析；用FITC-酪氨酸或FITC-亮氨酸检测氨基酸摄取；Western blot检测ATF4和P-EIF2α
AHCYL1结合蛋白的免疫共沉淀与质谱鉴定
鉴定AP中与AHCYL1结合减少的氨基酸转运体及去泛素化酶
用抗AHCYL1抗体从生理盐水或雨蛙肽+LPS处理的胰腺裂解液中富集结合蛋白，进行质谱、Western blot和免疫荧光验证
mTOR/PGK1/MIF轴的细胞及体内验证
验证mTOR抑制诱导PGK1及MIF表达，以及PGK1对MIF产生的调控
原代腺泡细胞用mTOR激活剂3BDO或PGK1抑制剂NG 52处理，检测p-mTOR、PGK1、p-P65、MIF表达和分泌；PPI网络和线性回归分析蛋白质组学数据
巨噬细胞迁移及SSAT调控验证
验证MIF诱导巨噬细胞迁移及SSAT上调，以及SSAT抑制剂对炎症的影响
Transwell实验检测巨噬细胞迁移；MIF处理巨噬细胞检测SSAT和细胞因子；SSAT抑制剂diminazene aceturate处理CKO AP小鼠检测血清细胞因子和巨噬细胞浸润
OTUD6B调控AHCYL1泛素化及AHCYL1恢复实验
探究AP中AHCYL1下调机制及AHCYL1恢复对AP的影响
免疫共沉淀和免疫荧光验证OTUD6B与AHCYL1结合；OTUD6B siRNA转染检测AHCYL1泛素化；AAV2-AHCYL1或重组AHCYL1恢复后检测细胞因子、HE染色和巨噬细胞浸润
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化和Western blot | AHCYL1抗体 | Proteintech | -- |
| Western blot | ATF4抗体 | Proteintech | -- |
| P-EIF2a抗体 | Proteintech | -- | |
| EIF2a抗体 | Proteintech | -- | |
| SLC7A5抗体 | Proteintech | -- | |
| SLC7A8抗体 | Affinity Biosciences | -- | |
| mTOR抗体 | CST | -- | |
| p-mTOR抗体 | CST | -- | |
| MIF抗体 | Abclonal | -- | |
| PGK1抗体 | HUABIO | -- | |
| HMGB1抗体 | HUABIO | -- | |
| LDHa抗体 | HUABIO | -- | |
| P65抗体 | Abclonal | -- | |
| p-P65抗体 | CST | -- | |
| SSAT抗体 | CST | -- | |
| PAOX抗体 | PTG | -- | |
| 淀粉酶抗体 | Proteintech | -- | |
| Actin抗体 | Sangon Biotech | -- | |
| Tubulin抗体 | Proteintech | -- | |
| 免疫组化 | CD68抗体 | Sangon Biotech | -- |
| CD3抗体 | Proteintech | -- | |
| MPO抗体 | Sangon Biotech | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 488) | abcam | -- |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 647) | abcam | -- | |
| AP诱导 | 雨蛙肽 | MCE | -- |
| 脂多糖 | Solarbio | -- | |
| 细胞处理 | 3BDO（mTOR激活剂） | MCE | -- |
| 代谢组学标准品 | 亚油酸 | MCE | -- |
| 二十二碳四烯酸 | MCE | -- | |
| γ-亚麻酸 | MCE | -- | |
| 腺苷 | MCE | -- | |
| 棕榈酰肉碱 | MCE | -- | |
| 甘氨酸 | MCE | -- | |
| 谷氨酸 | MCE | -- | |
| 酪氨酸 | MCE | -- | |
| SSAT抑制 | 二脒那秦 | MCE | -- |
| PGK1抑制 | NG 52（PGK1抑制剂） | MCE | -- |
| 细胞处理 | MIF重组蛋白 | PTG | -- |
| 氨基酸摄取实验 | FITC-酪氨酸 | Top-peptide Biotech | -- |
| FITC-亮氨酸 | Top-peptide Biotech | -- | |
| AHCYL1恢复实验 | 重组AHCYL1蛋白 | Origene | -- |
| 血清生化检测 | 全自动生化分析仪 | Mindray | -- |
| 细胞因子检测 | BCA细胞因子检测试剂盒 | BD | -- |
| 流式检测 | 流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | PTG | -- |
| 免疫共沉淀 | IP裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂Cocktail | MCE | -- | |
| Protein A/G磁珠 | Thermo Scientific Pierce | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AP动物模型构建 | AP诱导方式（雨蛙肽+LPS或牛磺胆酸）、给药剂量和频率、处死时间（末次雨蛙肽注射后3 h或TA注射后24 h）、小鼠品系和性别 阅读提示：Methods的Animal experiments小节及Fig. 1图注 |
| AHCYL1 CKO小鼠构建 | Cre-loxP系统、人PRSS1启动子驱动Cre、构建公司Cyagen Biosciences Inc、基因型鉴定（Figure S1） 阅读提示：Methods的Animal experiments小节及Fig. 1C |
| 原代腺泡细胞和巨噬细胞分离培养 | 胶原酶消化条件、培养基（DMEM+15% FBS或10% FBS）、37 °C 5% CO2、巯基乙酸盐诱导巨噬细胞96 h 阅读提示：Methods的Primary cell purification小节 |
| 药物处理浓度和时间 | 雨蛙肽200 nM+LPS 10 ng/mL处理6 h、3BDO或NG 52 10 μM、diminazene aceturate 5 mg/Kg、MIF 50 ng/mL、FITC-氨基酸1 mM处理20 min 阅读提示：Methods的Compound treatment小节及各Figure图注 |
| AHCYL1恢复实验 | AAV2-AHCYL1病毒剂量1×10^13 vg/mL注射4周、重组AHCYL1 1 mg/Kg（雨蛙肽模型）或0.1 mg/Kg（TA模型）、注射时间点 阅读提示：Methods的AHCYL1 recovery in mice小节及Fig. 7图注 |