样本收集与PPP-IF制备
获取各组血小板贫乏血浆不溶性组分用于蛋白质组学分析
采集各组参与者血液，离心制备血小板贫乏血浆，用10 mM AmBic稀释后离心获取不溶性沉淀（PPP-IF），进行双胰蛋白酶消化。
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血小板贫乏血浆不溶性组分中的翻译后修饰可区分COVID-19前体位性心动过速综合征、长新冠和长新冠-POTS：一项初步研究
Post-translational modifications in the insoluble fraction of platelet-poor plasma distinguish pre-COVID-19 Postural Orthostatic Tachycardia Syndrome, Long COVID, and Long COVID-POTS: a preliminary study
实验完整度
中对四组人血浆PPP-IF进行DIA LC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定差异蛋白和PTMs，但缺乏功能验证实验。
主要模型
健康对照者血小板贫乏血浆不溶性组分 PC-POTS患者血小板贫乏血浆不溶性组分 LC-IOH患者血小板贫乏血浆不溶性组分 LC-POTS患者血小板贫乏血浆不溶性组分
重点核对
各组样本量：健康对照n=18，PC-POTS n=20，LC-IOH n=19，LC-POTS n=18 PPP-IF制备：19倍稀释于10 mM AmBic，12,000×g离心10 min，取沉淀进行双胰蛋白酶消化 双胰蛋白酶消化：第一次1:5000蛋白酶:蛋白比例，室温过夜；第二次1:50比例，37°C孵育18 h LC-MS/MS分析：EvoSep One LC系统耦合timsTOF Pro 2，diaPASEF模式采集 差异分析阈值：|log₂FC| > 1且调整p值 < 0.05（Benjamini-Hochberg校正）
摘要
背景：COVID-19前体位性心动过速综合征（PC-POTS）、伴有初始体位性低血压的长新冠（LC-IOH）和长新冠-POTS（LC-POTS）主要是慢性病毒感染后疾病，症状严重，但常规实验室检查通常正常。我们此前在长新冠患者的血小板贫乏血浆不溶性组分（PPP-IF）中发现了淀粉样纤维微凝块复合物（FMCs），但尚不清楚PC-POTS和LC-POTS中是否也存在类似异常，或者翻译后修饰（PTMs）是否参与疾病机制。方法：对健康对照（n=18）、PC-POTS（n=20）、LC-IOH（n=19）和LC-POTS（n=18）参与者的血小板贫乏血浆PPP-IF进行蛋白质组学分析，采用双胰蛋白酶消化和数据非依赖LC-MS/MS。比较各组间的差异蛋白丰度、PTMs和淀粉样变性。结果：尽管显著失调的蛋白质很少，但在凝血、免疫和代谢通路中发现了广泛的疾病特异性PTM改变。LC-IOH表现出显著的AGE和氧化相关PTMs，位于纤维蛋白原子亚基上，尤其是纤维蛋白原α链（FIBA），类似于糖尿病糖基化谱。PC-POTS显示较少的纤维蛋白原PTMs，但代谢和免疫失调显著，包括氧化的apoA1和apoB以及补体相关蛋白（C3、C4A/B、IC1）、IGG1和A2MG。LC-POTS与LC-IOH共享凝血相关特征，与PC-POTS共享免疫相关特征。许多失调肽在计算机预测中具有高度淀粉样变性，与富含β折叠的FMCs一致。PTM失调显著大于蛋白质水平变化。结论：本研究首次提供证据表明PPP-IF内的PTMs有可能区分PC-POTS、LC-IOH和LC-POTS。由于PC-POTS样本早于SARS-CoV-2，其PTM特征反映了独立于COVID-19的内在疾病生物学。PTM分析揭示了LC-IOH和LC-POTS中的促凝血纤维蛋白原变化、LC-IOH和PC-POTS中的代谢-氧化失调以及PC-POTS和LC-POTS中的免疫失调。这些异常无法通过常规检测发现，可能促进微血管功能障碍。这些发现支持自主神经和病毒感染后疾病中的疾病特异性生物标志物开发和靶向治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PPP-IF中的翻译后修饰能否区分COVID-19前POTS、长新冠伴初始体位性低血压和长新冠-POTS？
- 核心机制
- PPP-IF中蛋白质的翻译后修饰失调（包括AGE、氧化、脱酰胺等）在凝血、免疫和代谢通路中呈现疾病特异性模式，且PTM失调程度远大于蛋白质丰度变化。
- 主要证据
- 对健康对照、PC-POTS、LC-IOH和LC-POTS四组PPP-IF进行DIA LC-MS/MS蛋白质组学分析，鉴定出29个独特基础肽（来自16种蛋白质）的64种独特修饰肽存在显著组间差异，且58.62%的基础肽具有淀粉样变性（AmyloGram评分>0.5）。
- 研究意义
- PPP-IF中的PTMs有潜力作为区分PC-POTS、LC-IOH和LC-POTS的疾病特异性生物标志物，并可能为靶向糖基化、氧化应激或补体激活的治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LC-MS/MS蛋白质组学数据采集
鉴定PPP-IF中的蛋白质和翻译后修饰
使用EvoSep One LC系统耦合timsTOF Pro 2质谱仪，以diaPASEF模式采集数据，原始文件用FragPipe处理。
差异蛋白和PTM分析
比较各组间蛋白质丰度和PTM差异
在Skyline中进行组间比较，提取调整p值和倍数变化，鉴定显著差异的蛋白质和修饰肽段。
淀粉样变性预测
评估差异肽段的淀粉样变性潜力
使用AmyloGram工具对差异基础肽进行计算机预测，计算淀粉样变性评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PPP-IF制备 | 碳酸氢铵 | -- | -- |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 三乙基碳酸氢铵 | -- | -- | |
| S-甲基硫代甲磺酸酯 | -- | -- | |
| 甲醇 | -- | -- | |
| LC-MS/MS分析 | EvoSep One液相色谱系统 | EvoSep | -- |
| timsTOF Pro 2质谱仪 | Bruker | -- | |
| EvoTip Pure tips | Evosep ApS | EV2011 | |
| EvoSep Performance色谱柱（8 cm × 150 μm，1.5 μm C18填料） | EvoSep | -- | |
| EvoSep Performance色谱柱（15 cm × 150 μm，1.5 μm C18填料） | EvoSep | -- | |
| Bruker CaptiveSpray ZDV Sprayer 20 | Bruker | -- | |
| Bruker Column Toaster | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与PPP-IF制备 | 血液离心条件（3000 rpm，10 min，4°C）、PPP稀释倍数（19倍于10 mM AmBic）、第一次胰蛋白酶消化比例（1:5000）和第二次消化比例（1:50）及时间温度 阅读提示：Methods中Sample collection和Sample preparation小节 |
| LC-MS/MS数据采集 | 色谱梯度（100、60、30、15 SPD）、色谱柱规格（8 cm或15 cm × 150 μm，1.5 μm C18）、质谱采集模式（diaPASEF） 阅读提示：Methods中Sample analysis on the EvoSep TimsTOF Pro-2小节 |
| 差异蛋白和PTM分析 | 显著性阈值（|log₂FC| > 1且调整p值 < 0.05）、多重比较校正方法（Benjamini-Hochberg）、肽段验证标准（至少4个碎片离子共洗脱） 阅读提示：Methods中Statistical analyses小节及Figure 2和Figure 3图注 |
| 淀粉样变性预测 | AmyloGram评分阈值（>0.5判定为淀粉样变性） 阅读提示：Results中There is extensive PTM dysregulation within the PPP-IF小节 |