时序转录组分析揭示DECTIN-1介导的棘阿米巴角膜炎免疫反应

Temporal Transcriptomic Profiling Reveals DECTIN-1-Mediated Immune Responses in Acanthamoeba Keratitis

作者信息Jinding Pang, Zhenyu Wei, Yuheng Zhang, Yuan Wei, Qingquan Shi, Qiankun Chen, Zijun Zhang, Sitong Shen, Bo Peng, Ahyan Ilman Qudsi, Sizhe Ji Wu, Qingfeng Liang
PMID42872947
发布时间2026-10-01
DOI10.1167/iovs.67.12.25

实验完整度

高

包含小鼠AK模型、角膜组织时序转录组、免疫浸润分析、体内表达验证及HCECs体外共培养验证。

主要模型

8周龄雌性C57BL/6小鼠角膜基质注射棘阿米巴AK模型 人角膜上皮细胞(HCECs)与棘阿米巴共培养

重点核对

AK组与对照组小鼠角膜组织在1、3、7 dpi的转录组比较,DEG阈值|log2 fold change|≥2且校正P<0.05 RT-qPCR检测Il6、Tnf-α、Mmp3及Clec7a、Syk、Nf-κb表达,以Gapdh归一化 免疫染色和Western blot检测DECTIN-1、SYK、NF-κB及IL-6、TNF-α、IL-17A、MPO、MMP3蛋白表达 HCECs与棘阿米巴按1:2比例共培养12小时后检测DECTIN-1表达

摘要

目的:本研究旨在探究棘阿米巴角膜炎(AK)中的动态免疫反应及DECTIN-1的作用。方法:建立AK小鼠模型,于感染后1、3和7天(dpi)收集角膜组织样本。进行转录组分析以分析差异表达基因和富集的基因本体术语。使用ImmuCellAI-mouse估计免疫细胞浸润。通过定量PCR、免疫染色和Western blotting验证DECTIN-1及相关信号分子的表达。进行体外实验以评估人角膜上皮细胞(HCECs)中DECTIN-1的表达。结果:AK进展以动态变化为特征,炎症反应在3 dpi达到峰值。免疫浸润分析显示早期先天免疫激活,随后在后期阶段涉及适应性免疫。时序转录组分析确定DECTIN-1在整个疾病进展中为显著上调基因。DECTIN-1/SYK/NF-κB信号通路的激活与促炎细胞因子表达增加相关。体外实验证实棘阿米巴直接诱导HCECs中DECTIN-1的表达。结论:DECTIN-1在AK期间动态上调,并可能在中介先天免疫反应和塑造免疫细胞动态中发挥潜在作用。这些发现为AK发病机制提供了新见解,并表明DECTIN-1作为潜在治疗靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
棘阿米巴角膜炎进展过程中免疫反应如何动态变化,以及DECTIN-1在宿主识别和炎症放大中扮演什么角色。
核心机制
DECTIN-1(Clec7a)在AK进展中动态上调,伴随DECTIN-1/SYK/NF-κB信号通路激活及促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-17a)表达增加,可能介导先天免疫反应并塑造免疫细胞动态。
主要证据
小鼠AK模型时序转录组显示DECTIN-1持续上调并与SYK/NF-κB通路激活相关;RT-qPCR、免疫染色和Western blot验证了DECTIN-1、SYK、NF-κB及促炎因子表达升高;HCECs体外共培养证实棘阿米巴直接诱导DECTIN-1表达。
研究意义
为AK发病机制提供了新见解,并提示DECTIN-1作为潜在治疗靶点,调控DECTIN-1介导的信号可能成为平衡宿主防御与炎症相关组织损伤的潜在策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

AK小鼠模型建立与临床评估

建立棘阿米巴角膜炎小鼠模型并评估疾病进展。

将棘阿米巴悬液注射至C57BL/6小鼠中央角膜基质,对照组注射PBS;于1、3、7 dpi进行裂隙灯观察、荧光素染色评分和活体共聚焦显微镜检查,并通过角膜刮片和组织培养确认模型建立。

2

角膜组织时序转录组分析

分析AK进展中基因表达动态变化及差异表达基因。

收集1、3、7 dpi角膜组织进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,进行GO富集分析和免疫细胞浸润分析(ImmuCellAI-mouse)。

3

炎症反应与DECTIN-1/SYK/NF-κB通路验证

验证转录组发现的炎症因子和DECTIN-1信号通路激活。

通过RT-qPCR、H&E染色、免疫组化、免疫荧光和Western blot检测促炎因子及DECTIN-1、SYK、NF-κB的表达。

4

HCECs体外共培养验证DECTIN-1直接诱导

验证棘阿米巴是否直接诱导角膜上皮细胞DECTIN-1表达。

HCECs单层培养后与棘阿米巴共培养,检测DECTIN-1表达变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
TRIzol试剂Invitrogen--
NanoDrop ND-1000分光光度计Thermo Fisher Scientific--
Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪Agilent Technologies--
RNA 6000 Nano LabChip试剂盒Agilent Technologies--
Qubit荧光计Thermo Fisher Scientific--
Dynabeads Oligo (dT)25磁珠Invitrogen--
镁离子RNA片段化模块New England Biolabs--
SuperScript II逆转录酶Invitrogen--
大肠杆菌DNA聚合酶INew England Biolabs--
RNase HNew England Biolabs--
dUTP溶液Thermo Fisher Scientific--
AMPureXP磁珠New England Biolabs--
热敏UDG酶New England Biolabs--
Illumina NovaseqTM 6000测序仪LC-Biotechnology CO., Ltd.--
HiScript III All-in-One RT SuperMixVazyme--
Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液Vazyme--
切片机Leica--
抗DECTIN-1抗体InvitrogenPA5-34382
抗SYK抗体InvitrogenPA5-27262
抗MMP3抗体Abcamab52915
抗K12抗体Abcamab185627
山羊抗兔IgG H&LAbcamab150077
抗NF-κB抗体Abcamab76302
抗TNF-α抗体Abcamab1793
抗IL-17a抗体Proteintech26163-1-AP
抗IL-6抗体Proteintech26404-1-AP
山羊抗兔IgG H&LAbcamab205718
山羊抗小鼠IgG H&LAbcamab205719
DAB显色液Beyotime Biotech--
抗GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig
抗MPO抗体Proteintech22225-1-AP
ChemiDoc成像系统Bio-Rad--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
AK小鼠模型建立
小鼠品系(8周龄雌性C57BL/6)、棘阿米巴接种量、注射体积与部位、对照组PBS体积、观察时间点1/3/7 dpi
阅读提示:Methods中Establishment of the Acanthamoeba Keratitis Mouse Model小节
转录组分析
样本分组与时间点、DEG阈值(|log2FC|≥2且校正P<0.05)、RNA完整性要求(RIN>7.0)、测序平台与读长
阅读提示:Methods中RNA Extraction and Sequencing及RNA-Seq Reads Mapping and Differentially Expressed Gene Analysis小节
免疫细胞浸润分析
分析工具(ImmuCellAI-mouse)、输入数据类型、免疫细胞分层定义
阅读提示:Methods中Pathway Enrichment and Immune Infiltration Analysis小节
RT-qPCR验证
逆转录试剂、qPCR预混液、热循环条件、归一化基因Gapdh、技术重复数
阅读提示:Methods中Quantitative Real-Time PCR小节
HCECs共培养实验
细胞系来源、棘阿米巴与细胞比例1:2、共培养时间12小时、检测DECTIN-1表达的方法
阅读提示:Methods中In Vitro Co-Culture Assay of Acanthamoeba With Corneal Epithelial Cells小节及Figure 5E图注