AK小鼠模型建立与临床评估
建立棘阿米巴角膜炎小鼠模型并评估疾病进展。
将棘阿米巴悬液注射至C57BL/6小鼠中央角膜基质,对照组注射PBS;于1、3、7 dpi进行裂隙灯观察、荧光素染色评分和活体共聚焦显微镜检查,并通过角膜刮片和组织培养确认模型建立。
Temporal Transcriptomic Profiling Reveals DECTIN-1-Mediated Immune Responses in Acanthamoeba Keratitis
包含小鼠AK模型、角膜组织时序转录组、免疫浸润分析、体内表达验证及HCECs体外共培养验证。
8周龄雌性C57BL/6小鼠角膜基质注射棘阿米巴AK模型 人角膜上皮细胞(HCECs)与棘阿米巴共培养
AK组与对照组小鼠角膜组织在1、3、7 dpi的转录组比较,DEG阈值|log2 fold change|≥2且校正P<0.05 RT-qPCR检测Il6、Tnf-α、Mmp3及Clec7a、Syk、Nf-κb表达,以Gapdh归一化 免疫染色和Western blot检测DECTIN-1、SYK、NF-κB及IL-6、TNF-α、IL-17A、MPO、MMP3蛋白表达 HCECs与棘阿米巴按1:2比例共培养12小时后检测DECTIN-1表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立棘阿米巴角膜炎小鼠模型并评估疾病进展。
将棘阿米巴悬液注射至C57BL/6小鼠中央角膜基质,对照组注射PBS;于1、3、7 dpi进行裂隙灯观察、荧光素染色评分和活体共聚焦显微镜检查,并通过角膜刮片和组织培养确认模型建立。
分析AK进展中基因表达动态变化及差异表达基因。
收集1、3、7 dpi角膜组织进行RNA-seq,鉴定差异表达基因,进行GO富集分析和免疫细胞浸润分析(ImmuCellAI-mouse)。
验证转录组发现的炎症因子和DECTIN-1信号通路激活。
通过RT-qPCR、H&E染色、免疫组化、免疫荧光和Western blot检测促炎因子及DECTIN-1、SYK、NF-κB的表达。
验证棘阿米巴是否直接诱导角膜上皮细胞DECTIN-1表达。
HCECs单层培养后与棘阿米巴共培养,检测DECTIN-1表达变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA完整性检测 | Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA定量 | Qubit荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| mRNA纯化 | Dynabeads Oligo (dT)25磁珠 | Invitrogen | -- |
| mRNA片段化 | 镁离子RNA片段化模块 | New England Biolabs | -- |
| cDNA合成 | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | New England Biolabs | -- | |
| RNase H | New England Biolabs | -- | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 文库构建 | AMPureXP磁珠 | New England Biolabs | -- |
| 热敏UDG酶 | New England Biolabs | -- | |
| 测序 | Illumina NovaseqTM 6000测序仪 | LC-Biotechnology CO., Ltd. | -- |
| RT-qPCR | HiScript III All-in-One RT SuperMix | Vazyme | -- |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 组织切片 | 切片机 | Leica | -- |
| 免疫荧光 | 抗DECTIN-1抗体 | Invitrogen | PA5-34382 |
| 抗SYK抗体 | Invitrogen | PA5-27262 | |
| 抗MMP3抗体 | Abcam | ab52915 | |
| 抗K12抗体 | Abcam | ab185627 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab150077 | |
| 免疫组化 | 抗NF-κB抗体 | Abcam | ab76302 |
| 抗TNF-α抗体 | Abcam | ab1793 | |
| 抗IL-17a抗体 | Proteintech | 26163-1-AP | |
| 抗IL-6抗体 | Proteintech | 26404-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Abcam | ab205718 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab205719 | |
| DAB显色液 | Beyotime Biotech | -- | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| 抗MPO抗体 | Proteintech | 22225-1-AP | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AK小鼠模型建立 | 小鼠品系(8周龄雌性C57BL/6)、棘阿米巴接种量、注射体积与部位、对照组PBS体积、观察时间点1/3/7 dpi 阅读提示:Methods中Establishment of the Acanthamoeba Keratitis Mouse Model小节 |
| 转录组分析 | 样本分组与时间点、DEG阈值(|log2FC|≥2且校正P<0.05)、RNA完整性要求(RIN>7.0)、测序平台与读长 阅读提示:Methods中RNA Extraction and Sequencing及RNA-Seq Reads Mapping and Differentially Expressed Gene Analysis小节 |
| 免疫细胞浸润分析 | 分析工具(ImmuCellAI-mouse)、输入数据类型、免疫细胞分层定义 阅读提示:Methods中Pathway Enrichment and Immune Infiltration Analysis小节 |
| RT-qPCR验证 | 逆转录试剂、qPCR预混液、热循环条件、归一化基因Gapdh、技术重复数 阅读提示:Methods中Quantitative Real-Time PCR小节 |
| HCECs共培养实验 | 细胞系来源、棘阿米巴与细胞比例1:2、共培养时间12小时、检测DECTIN-1表达的方法 阅读提示:Methods中In Vitro Co-Culture Assay of Acanthamoeba With Corneal Epithelial Cells小节及Figure 5E图注 |