OTiS通透性板构建与验证
建立高通量离体食管黏膜通透性检测平台并验证密封性和组织完整性。
用透明树脂3D打印24孔底板和铝制压缩板，磁力密封组织条；用FD4验证无孔间泄漏；比较液氮和异戊烷速冻对组织形态及FITC、FD4、罗丹明B通透性的影响；测定不同分子量探针的通透性截止。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
用于评估生物制剂在食管滞留和黏膜吸收的食管组织筛选系统
Oesophageal tissue screening system for assessing the retention and mucosal absorption of biologics
实验完整度
高含离体猪/人食管黏膜通透性筛选、多种水凝胶表征及猪体内滞留与英夫利西单抗摄取验证，并有机制验证。
主要模型
离体猪食管黏膜组织 离体人食管黏膜组织 猪（Sus scrofa domestica）体内模型
重点核对
FD4（4 kDa）在离体猪食管黏膜的表观渗透系数：Oeso-gel较不含PEs水凝胶增加876倍，人食管增加285倍 3% w/v i-卡拉胶水凝胶的FD4 Papp为9.23×10−4 ± 0.9×10−4 cm h−1，显著高于3.5% w/v karaya gum和1% w/v xanthan gum 体内英夫利西单抗剂量为1 mg ml−1，Oeso-gel组n=3，对照水凝胶组n=2，给药后2 h、4 h及第3天取活检 离体通透性实验使用至少3只动物的组织，每组n=3独立生物学重复 PEs为25 mM CDC与100 mM SCH的二元混合物，水凝胶为3% w/v i-卡拉胶
摘要
向食管递送药物面临独特挑战，包括重力导致的快速转运时间和复层鳞状非角化上皮的存在。为快速筛选可增强食管药物递送的辅料配方，我们开发了一种食管组织筛选系统，由特制定制板（用于纳入重力效应）和离体食管黏膜组织组成。利用该筛选系统，我们构建了辅料库，鉴定出最有效的无毒渗透促进剂，并筛选出能够延长在食管黏膜上滞留时间的配方。我们鉴定出一种吸收促进剂，使模型药物（4 kDa）在猪组织中的食管转运增加了876倍。我们在人食管组织和猪体内用模型药物及英夫利西单抗（149 kDa）验证了该配方，证明其通透性增强。我们表征了该方法的机制，注意到其能够增强递送而不引起食管组织的细胞破坏。该食管组织筛选系统有望用于食管药物递送系统的高通量筛选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种高通量食管组织筛选系统，鉴定可延长食管滞留并增强大分子生物制剂黏膜吸收的配方？
- 核心机制
- 胆盐渗透促进剂通过结合游离钙离子，引起紧密连接和黏附连接蛋白（Claudin 4、E-cadherin）膜定位暂时性改变，促进旁细胞转运；该作用在体内可逆。
- 主要证据
- 离体猪和人食管黏膜通透性实验显示FD4 Papp分别增加876倍和285倍；免疫组化和免疫荧光显示连接蛋白膜染色减少但无组织损伤；猪体内内镜给药后英夫利西单抗在黏膜基底层的摄取与TNF共定位，且第3天仍可检测到。
- 研究意义
- Oeso-gel有潜力作为非侵入性、可自我给药的食管靶向药物递送平台，用于增强抗体治疗药物在食管疾病治疗中的黏膜摄取和滞留。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
离体辅料渗透促进剂筛选
从辅料库中鉴定能增强FD4通透且不损伤食管黏膜的渗透促进剂。
用OTiS平台筛选101种化学实体，以FD4为模型大分子，检测表观渗透系数；对增强效果大于5倍的辅料进行H&E组织学评估；将安全有效的辅料两两组合，计算协同值。
水凝胶配方筛选与流变学表征
筛选具有适宜流变学和黏膜黏附性能的聚合物水凝胶，用于食管滞留。
将纤维素衍生物和多糖以不同浓度溶于含25 mM CDC和100 mM SCH的PBS中，磁力搅拌24 h；用Discovery HR-3流变仪进行应变扫描、频率扫描、时间扫描和剪切速率扫描；用猪食管黏膜进行离体黏膜黏附流变学评估。
离体滞留与通透性验证
在模拟重力方向和唾液清除的条件下评估水凝胶滞留和FD4通透性。
用垂直板装置，将1 ml水凝胶应用于组织上端，以0.3 ml min−1流速灌流SSF pH 6.8，记录30 min内累积洗脱量；在含FD4 2 mg g−1的水凝胶中检测4 h内FD4累积通透性；并用X射线成像观察全食管滞留。
人食管组织验证与连接蛋白机制分析
在人食管组织验证配方通透性增强效果并分析紧密连接和黏附连接蛋白变化。
在离体人食管黏膜上比较含与不含PEs的3% w/v i-卡拉胶水凝胶的FD4 Papp；用IHC和免疫荧光检测Claudin 4和E-cadherin；用钙敏感染料Pontachrome Violet SW检测胆盐对游离钙的络合。
猪体内滞留与英夫利西单抗摄取评估
在大型动物模型中评估Oeso-gel的食管滞留、黏膜摄取和连接蛋白可逆性。
雌性约克夏猪镇静后置于半直立位，内镜下将3 ml Oeso-gel或对照水凝胶递送至食管；给药后2 h、4 h和第3天取食管黏膜活检，进行H&E、英夫利西单抗、TNF、E-cadherin和Claudin 4的IHC；检测血清英夫利西单抗水平。
吸管给药装置构建与复水验证
开发便于长期储存和自我给药的吸管装置，并验证冻干复水后水凝胶性能。
将含PEs的3% w/v i-卡拉胶水凝胶装入硅胶吸管，加入静态混合器后冻干48 h；用碳酸水或普通水复水，比较不同混合器的均匀性、挤出量和流变学及离体滞留性能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| OTiS平台制造 | VeroClear树脂 | Objet260 Connex3 | -- |
| 6061铝合金 | Protolabs | -- | |
| N52级磁铁 | -- | -- | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Loctite | 411 | |
| 促进剂 | Loctite | SF 712 | |
| 离体通透性实验 | FITC-葡聚糖（FD4） | -- | -- |
| 罗丹明B | -- | -- | |
| 荧光定量 | Infinite 200 PRO酶标仪 | Tecan | -- |
| IgG定量 | Easy-Titer兔IgG检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 水凝胶制备 | i-卡拉胶 | Sigma | C1138 |
| 黄原胶 | Sigma | G1253 | |
| karaya胶 | Sigma | G0503 | |
| 西黄蓍胶 | Sigma | G1128 | |
| 海藻酸钠 | Sigma | 180947 | |
| 果胶 | Sigma | P9135 | |
| 瓜尔胶 | Sigma | G4129 | |
| 刺槐豆胶 | Sigma | G0753 | |
| 羧甲基纤维素，低粘度 | Sigma | C5678 | |
| 羧甲基纤维素钠，分子量90,000 g mol−1 | Sigma | 419273 | |
| 羧甲基纤维素，分子量700,000 g mol−1 | Sigma | 419338 | |
| 羟乙基纤维素 | TCI | H0418 | |
| 羟丙基纤维素 | Alfa Aesar | 43400 | |
| 羟丙基甲基纤维素 | Sigma | H7509 | |
| 流变学测量 | Discovery HR-3混合流变仪 | TA Instruments | -- |
| 免疫组化 | Claudin 4兔抗人多克隆抗体 | ThermoFisher Scientific | PA5-32354 |
| E-cadherin抗人多克隆抗体 | ThermoFisher Scientific | PA5-80457 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG二抗 | ThermoFisher Scientific | A-11008 |
| 免疫荧光成像 | Nikon A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 钙络合实验 | Pontachrome Violet SW染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 体内免疫组化 | 人抗英夫利西单抗抗体 | Bio-Rad | HCA212 |
| 小鼠抗V5标签HRP抗体 | Bio-Rad | MCA1360P | |
| 抗TNFα抗体 | Abcam | ab6671 | |
| 血清英夫利西单抗定量 | 酶联免疫吸附实验试剂盒 | MyBiosource.com | -- |
| 吸管装置制造 | Clear Resin v4树脂 | Formlabs | -- |
| Form 2打印机 | Formlabs | -- | |
| Formlabs Form Wash清洗机 | Formlabs | -- | |
| Formlabs Form Cure固化机 | Formlabs | -- | |
| 冻干 | Labcono Freezone 2.5 l冻干机 | Labcono | 700201000 |
| 吸管装置制造 | 钢珠 | McMaster Carr | 9587K1 |
| 塑料珠 | McMaster Carr | 96455K51 | |
| 体内给药 | 英夫利西单抗（类克） | Remicade | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 离体辅料筛选 | FD4浓度0.5 mM、100 μl加入供体孔；37°C；每小时取样至8 h；至少3只动物的组织 阅读提示：Methods 中 'Ex vivo permeability excipient screening' 小节及Supplementary Table 1 |
| 水凝胶配方与流变学 | 聚合物浓度（如3% w/v i-卡拉胶、1% w/v黄原胶、3.5% w/v karaya gum）；PEs为25 mM CDC + 100 mM SCH；流变仪参数（20 mm板，500 μm间隙，25°C） 阅读提示：Methods 中 'Formulation approach' 和 'Rheological measurements' 小节 |
| 离体滞留与通透性 | SSF pH 6.8流速0.3 ml min−1；FD4 2 mg g−1；水凝胶1 ml；受体室3 ml PBS pH 7.4；取样至4 h 阅读提示：Methods 中 'Ex vivo permeability formulation screening' 和 'Formulation retention on oesophageal mucosa' 小节 |
| 人食管组织实验 | 人组织来源NDRI，6名供者；FD4 2 mg g−1；4 h通透性实验；IHC抗体稀释比例 阅读提示：Methods 中 'Tissue preparation and storage' 和 'IHC and immunofluorescent staining' 小节 |
| 猪体内实验 | 雌性约克夏猪4–8月龄，体重40–103 kg；英夫利西单抗1 mg ml−1；Oeso-gel 3 ml；Oeso-gel组n=3，对照n=2；活检2 h、4 h、第3天 阅读提示：Methods 中 'In vivo studies' 小节及Fig. 7图注 |