区域特异性胃类器官建立与鉴定
验证不同胃区域来源的类器官是否保留区域身份。
从儿科患者胃窦、胃体、胃底黏膜活检分离腺体，培养为类器官，并用免疫荧光和RNA-seq检测区域标志物。
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人胃多区域组装体用于功能性壁细胞成熟及胃窦小凹增生的患者特异性建模
Human gastric multi-regional assembloids for functional parietal maturation and patient-specific modelling of antral foveolar hyperplasia
实验完整度
高含患者来源类器官、多区域组装体、功能酸分泌检测、体内移植及RNA-seq多层级验证
主要模型
儿科患者来源胃窦、胃体、胃底类器官 单区域组装体(SRA) 多区域组装体(MRA) 免疫缺陷NSG小鼠皮下植入模型
重点核对
胶原I水凝胶浓度0.75 mg/ml为组装体形成最优条件 MRA组装顺序为胃底-胃体-胃窦，悬浮培养10天 壁细胞功能验证使用100 μM组胺和100 μM奥美拉唑处理，吖啶橙染色检测酸分泌 PMM2-MRA中验证糖基化ATPase β/前体比值及ATP4B表达 NSG小鼠皮下植入后4周取材分析
摘要
患者来源的人源类器官能够自组织形成更复杂的结构。然而，胃类器官在多大程度上能够重现分化细胞类型和黏膜功能仍未可知。在此，我们报道了区域特异性胃类器官如何自组装形成复杂的多区域组装体。这些组装体显示出复杂性增加以及不同胃区域之间的交叉通讯，使得难以捉摸的、负责胃酸产生并对靶向H+/K+ ATP酶泵的药物表现出功能性反应的壁细胞类型得以出现。我们利用来自患有与异常胃窦小凹增生和增生性息肉病相关的遗传病儿科患者的组织生成了组装体。我们的多区域组装体有效地重现了增生样胃窦区域，表现为黏蛋白分泌减少和糖基化H+/K+ ATP酶β亚基减少，从而导致胃酸分泌受损。使用儿科干细胞来源类器官生成的多区域胃组装体成功重现了人胃的结构和功能特征，为研究此前在原代模型中难以研究的胃上皮相互作用和疾病机制提供了有前景的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人胃区域特异性类器官能否自组装成多区域组装体以重现胃黏膜分化细胞类型和功能，并用于疾病建模。
- 核心机制
- 多区域组装体中不同胃区域之间的交叉通讯促进胃上皮细胞分化，使功能性壁细胞自发出现并产生组胺反应性胃酸分泌；PMM2变异导致N-糖基化缺陷，使糖基化ATPase β减少，胃酸分泌受损。
- 主要证据
- 患者来源胃类器官构建SRA和MRA，通过RNA-seq、TOBis MC、WES、免疫荧光和吖啶橙活细胞成像验证壁细胞标志物ATPase β及酸分泌功能，并在NSG小鼠体内验证组装体存活。
- 研究意义
- 多区域胃组装体可重现人胃结构和功能特征，为研究胃上皮相互作用和疾病机制提供此前原代模型难以实现的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单区域及多区域组装体构建
建立使类器官自组装为更复杂结构的悬浮培养体系。
将成熟类器官从Matrigel释放，重悬于胶原I水凝胶，在定制PDMS孔中悬浮培养，形成SRA或按胃底-胃体-胃窦顺序形成MRA。
组装体形态与区域身份验证
确认组装体形成共享管腔、腺体样结构并保留区域标志物。
明场成像、免疫荧光、透射电镜和全mount染色检测E-cadherin、MUC5AC、MUC6、CHGA、PDX1、PGC等。
转录组和配体-受体通讯分析
比较类器官、SRA和MRA的基因表达差异及区域间通讯通路。
对组织、类器官、SRA和MRA进行bulk RNA-seq，PCA、DEG和配体-受体对分析。
壁细胞分化与功能验证
检测MRA中是否出现功能性壁细胞及胃酸分泌。
TOBis MC单细胞蛋白分析、WES检测糖基化ATPase β、免疫荧光计数ATPase β阳性细胞，以及吖啶橙活细胞成像检测组胺/奥美拉唑反应。
体内移植验证
评估组装体在免疫缺陷小鼠体内的存活和结构维持。
将SRA和MRA皮下植入NSG小鼠，4周后取材进行micro-CT、H&E和免疫荧光分析。
PMM2-HIPKD-IBD疾病建模
利用MRA重现PMM2相关胃窦小凹增生表型。
从2名PMM2-HIPKD-IBD患者活检来源类器官构建MRA，检测增生、黏蛋白分泌、ATPase β糖基化和酸分泌功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应与细胞功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胃腺分离 | Advanced DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634 |
| HEPES缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma–Aldrich | A9418 | |
| 无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma–Aldrich | D8537 | |
| 含钙镁杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma–Aldrich | D8662 | |
| 类器官培养 | 生长因子减少型Matrigel | Corning | 354230 |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| 类器官传代 | TrypLE Express酶 | Thermo Fisher Scientific | 12605010 |
| 报告细胞系构建 | Accumax细胞解离液 | Thermo Fisher Scientific | 00-4666-56 |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| 培养孔制作 | SYLGARD 184硅胶试剂盒 | Dow Corning | -- |
| 组装体培养 | 细胞回收液 | Corning | 354253 |
| 超低吸附24孔组织培养板 | Corning | 3473 | |
| 厄洛替尼 | Cambridge Bioscience | 10483-500-CAY | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 布比卡因 | -- | -- | |
| VICRYL RAPIDE缝线 | Ethicon | VR493 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 甲醇 | Sigma–Aldrich | 34860 | |
| 甘氨酸 | Sigma–Aldrich | 410225 | |
| 正常驴血清 | Sigma–Aldrich | D9663 | |
| Tween 20 | Sigma–Aldrich | P1379 | |
| 肝素 | Sigma–Aldrich | H3149 | |
| 酸分泌功能检测 | 奥美拉唑 | Sigma–Aldrich | O104 |
| 吖啶橙 | Thermo Fisher Scientific | A1301 | |
| 组胺 | Sigma–Aldrich | H7127 | |
| micro-CT | 三碘化钾 | Chemondis | II0181 |
| 福尔马林 | Sigma–Aldrich | HT501128 | |
| 营养琼脂 | Thermo Fisher Scientific | BO0336B | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| KAPA mRNA HyperPrep试剂盒 | Roche | KK8580 | |
| NEBNext低输入RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E6420 | |
| TOBis MC | 谷胱甘肽 | Sigma–Aldrich | G6529 |
| Maxpar细胞染色缓冲液 | Standard BioTools | 201068 | |
| II型分散酶 | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| IV型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNase I | Sigma–Aldrich | DN25 | |
| gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-093237 | |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Maxpar X8聚合物 | Standard BioTools | 201300 | |
| 甲醛 | Pierce | 28906 | |
| Cell-ID Intercalator-Ir | Standard BioTools | 201192A | |
| Maxpar固定通透缓冲液 | Standard BioTools | 201067 | |
| Maxpar CAS+溶液 | Standard BioTools | 201244 | |
| EQ6珠 | Standard BioTools | 201245 | |
| WES | RIPA裂解液 | Sigma–Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂 | Abcam | ab270055 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 抗体稀释液2 | Bio-Techne | 042-203 | |
| Wes仪器 | Bio-Techne | 004-600 | |
| 12–230 kDa分离模块 | Bio-Techne | 004-600 | |
| H+/K+ ATP酶β抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA3-923 | |
| 抗小鼠检测模块 | Bio-Techne | DM-002 | |
| 总蛋白检测模块 | Bio-Techne | DM-TP01 | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Universal SYBR Green Master Rox | Merck Life Sciences | 4913850001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多区域组装体构建 | 胶原I水凝胶浓度0.75 mg/ml；类器官接种密度；悬浮培养10天；MRA按胃底-胃体-胃窦顺序接种；每区域2滴30 μl完全生长类器官 阅读提示：Methods中Floating gastric SRA and MRA cultures小节及Extended Data Fig. 1f |
| 壁细胞功能验证 | 组胺100 μM处理1小时；奥美拉唑100 μM预处理1小时；吖啶橙10 μM；成像时间间隔10分钟共1小时 阅读提示：Methods中Acridine orange小节及Fig. 4g-j图注 |
| PMM2疾病建模 | 2名PMM2-HIPKD-IBD患者来源；包含增生性息肉来源类器官；ATP4B RT-qPCR和WES糖基化/前体比值检测 阅读提示：Results中MRA model of PMM2–HIPKD–IBD gastric manifestation小节及Fig. 5图注 |
| 体内移植 | NSG小鼠12周龄；皮下植入4周；每只小鼠最多4个移植物；bupivacaine 8 mg/kg；buprenorphine 0.1 mg/kg 阅读提示：Methods中Subcutaneous implantation of gastric assembloids in mice小节 |
| 类器官培养与传代 | Matrigel液滴30 μl；Y-27632 10 μM用于前3-4天；传代比例1:3至1:15；培养基每3天更换 阅读提示：Methods中Gastric gland isolation和Passaging of gastric organoids小节 |