构建人源化颗粒蛋白前体缺陷移植模型
在允许人iPSC来源小胶质细胞稳定植入的体内环境中，将颗粒蛋白前体恢复限定于小胶质细胞。
将GrnR493X/R493X小鼠与hCSF1+/+/Rag2−/−/Il2rg−/y背景回交，生成hCSF1-Grn−/−受体；在P1–2新生小鼠脑室内注射WTxMG或PBS对照。
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移植人iPSC来源的小胶质细胞可改善颗粒蛋白前体缺陷小鼠的神经病理和环路功能障碍
Transplantation of human iPSC-derived microglia ameliorates neuropathology and circuit dysfunction in progranulin-deficient mice
实验完整度
高含体外iPSC小胶质细胞移植、hCSF1-Grn−/−小鼠体内模型、sn-RNAseq、电生理和行为验证等多层级功能与机制验证。
主要模型
hCSF1-GrnR493X/R493X（hCSF1-Grn−/−）小鼠 WTC11人iPSC来源小胶质祖细胞（WTxMG） 同基因GRN−/−人iPSC来源小胶质祖细胞（KOxMG） 离体丘脑水平脑片多单位电生理记录
重点核对
人小胶质细胞植入比例：海马84%、丘脑73%（12月龄hCSF1-Grn−/− + WTxMG） 移植细胞量：每只小鼠500,000个HPCs，P1–2脑室内注射，每点2 µl、125,000 cells/µl、共4个注射点 行为学评估时间点：9.5月龄；电生理与sn-RNAseq取材：10.5–11.5月龄 主要分组：hCSF1对照+PBS、hCSF1-Grn−/−+PBS/KOxMG、hCSF1-Grn−/−+WTxMG
摘要
额颞叶痴呆（FTD）是早发性神经退行性变的主要原因，以进行性行为、情感和认知衰退为特征。颗粒蛋白前体单倍剂量不足是家族性FTD的主要遗传原因，可破坏多种细胞类型中的溶酶体功能、脂质代谢、自噬和神经免疫信号传导。越来越多证据表明，小胶质细胞对颗粒蛋白前体丢失尤为敏感，补体激活升高，进而导致TDP-43蛋白病和神经元功能障碍。在此，我们通过将人诱导多能干细胞来源的小胶质祖细胞移植到颗粒蛋白前体（Grn）缺陷小鼠中，研究仅在微胶质细胞内恢复颗粒蛋白前体的生物学作用。我们发现，野生型而非Grn缺陷的人小胶质细胞植入可恢复全脑颗粒蛋白前体水平，使小胶质细胞转录状态正常化，并改善与颗粒蛋白前体丢失相关的病理、功能和行为表型。由于人小胶质细胞是该系统中颗粒蛋白前体的唯一来源，这些发现表明，小胶质细胞来源的颗粒蛋白前体足以在颗粒蛋白前体缺陷的FTD模型中恢复细胞、环路和行为稳态的关键方面。更广泛地说，这项工作突出了颗粒蛋白前体在维持脑功能中的中枢性、小胶质细胞内在作用，并为在FTD及相关神经退行性疾病中剖析小胶质细胞特异性机制提供了框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 仅在微胶质细胞中恢复颗粒蛋白前体是否足以改善颗粒蛋白前体缺陷相关FTD模型的神经病理、环路和行为异常。
- 核心机制
- 小胶质细胞来源的颗粒蛋白前体维持小胶质细胞稳态、抑制补体和I型干扰素相关炎症程序，并通过对星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的非细胞自主作用维持神经免疫稳态与环路功能。
- 主要证据
- 野生型人iPSC来源小胶质细胞植入hCSF1-Grn−/−小鼠后恢复脑内颗粒蛋白前体水平，减少脂褐素、SCMAS、LAMP1和CD68病理及促炎因子，sn-RNAseq显示促稳态、抗炎转录状态并抑制补体/干扰素程序，电生理显示挽救了丘脑延迟性放电亢进，行为学显示改善了过度理毛和社交缺陷。
- 研究意义
- 研究将小胶质细胞颗粒蛋白前体定位为维持脑功能的关键调节因子，并为剖析FTD及相关神经退行性疾病中小胶质细胞特异性机制提供了框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证人小胶质细胞植入与颗粒蛋白前体恢复
确认移植的人小胶质细胞长期植入并恢复脑内颗粒蛋白前体水平。
在12月龄时通过IHC检测GFP/Iba1标记的人小胶质细胞比例，并通过ELISA检测脑、肝、脾和血浆中人或小鼠颗粒蛋白前体水平。
评估溶酶体与脂褐素相关病理
检验仅在小胶质细胞恢复颗粒蛋白前体是否改善Grn缺陷相关溶酶体功能障碍和脂褐素沉积。
在12月龄hCSF1、hCSF1-Grn−/−+PBS和hCSF1-Grn−/−+WTxMG小鼠中，通过共聚焦显微镜检测未染色切片的自发荧光、SCMAS和LAMP1免疫标记。
评估神经炎症和小胶质细胞活化
验证野生型人小胶质细胞移植是否降低Grn缺陷脑内促炎因子和小胶质细胞活化标志物。
使用多重ELISA检测可溶性脑提取物中的细胞因子/趋化因子，并通过IHC定量CD68和Iba1。
比较WTxMG与KOxMG的人小胶质细胞及小鼠胶质细胞转录状态
剖析颗粒蛋白前体充足或缺陷的人小胶质细胞对自身及周围小鼠星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的非细胞自主影响。
在9.5月龄进行行为学测试后，于10.5–11.5月龄取海马和丘脑进行单核RNA测序，并通过ELISA验证C1Q、MBP和DUSP15等蛋白水平。
评估丘脑环路兴奋性
检验WTxMG是否挽救Grn缺陷小鼠丘脑网络高兴奋性。
制备包含VB和nRT的400 µm水平丘脑切片，在内侧内囊电刺激后使用16通道多电极阵列记录多单位活性。
评估理毛和社交行为
验证小胶质细胞颗粒蛋白前体恢复是否改善Grn缺陷小鼠的重复理毛和社交缺陷。
在透明底面旷场中录制20分钟理毛行为；在三箱社交装置中进行10分钟习惯化和10分钟测试，记录主动接近时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| iPSC培养与基因编辑 | 基质胶 | -- | -- |
| TeSR-E8培养基 | -- | -- | |
| Accutase细胞消化液 | -- | -- | |
| 人干细胞核转染缓冲液 | Lonza | -- | |
| HiFi Cas9核酸酶 | IDTDNA | -- | |
| Amaxa核转染程序B-016 | Lonza | -- | |
| HPC分化 | STEMdiff造血试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05310 |
| HPC冻存 | BamBanker冻存液 | Wako | NC9582225 |
| 细胞移植 | 1× DPBS（低钙、低镁） | -- | -- |
| Hamilton注射器 | Hamilton | 10µL | |
| 脑组织蛋白提取 | T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo Scientific | 78510 |
| 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78426 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白测定试剂盒 | Pierce | -- |
| ELISA | 人颗粒蛋白前体ELISA | R&D Systems | DY2420 |
| 小鼠髓鞘碱性蛋白ELISA | antibodies-online.com | ABIN6957934 | |
| V-PLEX Plus小鼠细胞因子19重检测试剂盒 | Meso Scale Discovery | K15255G | |
| 免疫组织化学 | 山羊抗IBA1抗体 | Abcam | ab5076 |
| 兔抗IBA1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| 大鼠抗LAMP1抗体 | Abcam | ab25245 | |
| 兔抗SCMAS抗体 | Abcam | ab181243 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Millipore-Sigma | AB16901 | |
| 大鼠抗CD68抗体 | Bio-Rad | MCA1957 | |
| AlexaFluor标记二抗 | ThermoFisher | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| 驴血清 | ThermoFisher Scientific | NC9624464 | |
| 1× PBS | Sigma-Aldrich | P44017-100TAB | |
| 单核RNA测序 | Sigma细胞核PURE裂解缓冲液 | Sigma | NUC201-1KT |
| Dounce组织研磨器 | Sigma | D8938-1SET | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 37525 | |
| 二硫苏糖醇 | Thermo Fisher Scientific | 426380500 | |
| 重组RNase抑制剂 | Ambion | AM2684 | |
| Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN-1000268 | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 电生理 | Leica VT1200切片机 | Leica Microsystems | -- |
| 线性16通道多电极阵列 | Neuronexus | -- | |
| RZ5系统 | Tucker-Davis Technologies | -- | |
| 双极钨微电极 | FHC | -- | |
| 行为学 | 4K摄像机 | -- | -- |
| 4K Logitech网络摄像头 | Logitech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人iPSC小胶质祖细胞移植 | 移植时间P1–2、细胞量500,000 HPCs/小鼠、每点2 µl、125,000 cells/µl、共4个注射点、注射深度3 mm和1 mm、对照PBS 阅读提示：Methods：Intracranial transplantation at post-natal days 1–2；Experimental design |
| hCSF1-Grn−/−模型构建 | GrnR493X/R493X与hCSF1+/+/Rag2−/−/Il2rg−/y回交，混合BALB/c × B6.129遗传背景，实验与对照为同窝匹配 阅读提示：Methods：Mouse generation and husbandry |
| WTxMG与KOxMG等基因比较 | WTxMG为WTC11-mEGFP来源，KOxMG为同基因GRN−/− iPSC来源；主要比较WTxMG与KOxMG，直接检验微胶质细胞颗粒蛋白前体是否为表型挽救所必需 阅读提示：Methods：Induced pluripotent stem cell lines；Experimental design |
| sn-RNAseq与ELISA验证 | sn-RNAseq每组n=3脑；10.5–11.5月龄取材；测序100 cycles；DEG阈值FDR<0.05且|log2FC|>0.1；C1Q、MBP、DUSP15 ELISA样本量分别为n=5、n=3、n=7 阅读提示：Methods：Single-nuclei RNA sequencing；Quantitative biochemical analysis；Fig. 3M、Fig. 4J–K |
| 电生理记录与行为学 | 电生理：400 µm水平丘脑切片、34 °C、刺激50 V/100 µs/每30 s、早期0–1.5 s和延迟1.5–3 s；行为学：9.5月龄、理毛20 min、三箱社交10 min habituation和10 min testing 阅读提示：Methods：Electrophysiology；Recordings；Behavior；Grooming；Three-chamber sociability test |