临床分离株采集与确认
获取经种特异性qRT-PCR确认的间日疟原虫单一感染临床分离株。
在加蓬Moyen-Ogooué省开展横断面家庭监测，采集患者全血，离心去除白细胞，用于涂片、流式、冻存及RNA提取。
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间日疟原虫对年轻红细胞和骨髓的趋向性
Tropism of Plasmodium malariae for young red blood cells and the bone marrow
实验完整度
高离体临床分离株流式与成像流式分析，以及人源化HIS-HEry小鼠体内感染验证，含功能与机制验证。
主要模型
加蓬间日疟原虫单一感染患者外周血分离株（n=4） 恶性疟原虫单一感染患者外周血分离株（n=10）及巴西间日疟原虫分离株（n=3） 人源化HIS-HEry小鼠（n=9，植入2份脐血CD34+造血祖细胞）
重点核对
临床分离株分组：间日疟原虫n=4、恶性疟原虫n=10、间日疟原虫n=3，均经种特异性qRT-PCR确认为单一感染 流式染色标志物及浓度：Hoechst 33342 16.2 µM、CD45-FITC、CD71-PE-Vio615、CD235a-AlexaFluor647 HIS-HEry小鼠感染：感染前1天及之后每5天静脉注射200 µL氯膦酸盐脂质体，经眶后注射2.5×10⁶–5×10⁶感染红细胞，感染后第9天取材 寄生虫定量：以pLN-Pm18S质粒标准品（5–5×10⁹拷贝/µL）进行18S rRNA qPCR，Cq<38判为阳性 统计方法：图1(a)采用混合效应逻辑回归，图3(b)采用Wilcoxon符号秩检验，P<0.05为显著
摘要
人类第三大流行疟疾物种间日疟原虫（Plasmodium malariae）的生物学基础，包括其建立慢性低密度感染并伴发致衰弱性三日热的能力，仍鲜有表征，阻碍了防控工作。在此，我们将间日疟原虫分离株的离体流式细胞术分析与近期开发的人源化小鼠模型感染研究相结合。我们证明，与恶性疟原虫相比，间日疟原虫对未成熟红细胞具有高5倍的趋向性，挑战了近一个世纪以来的范式，并首次提供证据表明该寄生虫能够归巢至并感染宿主骨髓。总体而言，这些发现揭示了这一神秘且被忽视的人类疟疾寄生虫的关键生活史特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 间日疟原虫是否对特定红细胞亚群具有趋向性，以及其能否归巢至并感染骨髓。
- 核心机制
- 间日疟原虫优先感染CD71+未成熟红细胞（网织红细胞），并可在骨髓中归巢并选择性感染CD71+红系细胞，提示骨髓作为其感染生态位。
- 主要证据
- 离体流式与成像流式显示间日疟原虫感染CD71+网织红细胞比例较恶性疟原虫高5倍；HIS-HEry小鼠感染后第9天，9只小鼠骨髓均检出寄生虫18S rRNA，且成像流式显示骨髓CD235a+CD71+细胞内有DAPI+感染细胞。
- 研究意义
- 重新定义了间日疟原虫的宿主细胞趋向性，确立骨髓为潜在庇护所，并建立HIS-HEry小鼠模型用于研究该病原体生物学，可能有助于改进诊断和治疗以实现疟疾彻底消除。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
离体流式细胞术分析红细胞趋向性
评估间日疟原虫对CD71+网织红细胞与CD71-成熟红细胞的感染比例。
取1 µL去白细胞红细胞，Hoechst 33342染色30分钟，再染CD45-FITC和CD71-PE-Vio615，在BD Symphony A1上采集至少100万事件，FlowJo分析。
成像流式验证感染细胞类型
直观确认间日疟原虫感染CD71+年轻网织红细胞。
对冻存分离株红细胞染色Hoechst 33342、anti-CD45-FITC、anti-CD71-PE-Vio615、anti-CD235a-AlexaFluor647，在ImageStream ISX MkII上分析，IDEAS软件处理。
寄生虫血症与虫期分析
确定间日疟原虫感染红细胞中的虫期分布及DNA含量。
对同一批外周血分离株进行Giemsa涂片显微镜检查虫期，并用Hoechst荧光强度区分早期与晚期寄生虫。
人源化HIS-HEry小鼠感染实验
验证间日疟原虫能否归巢并感染骨髓。
将人CD34+造血祖细胞经肝内注射至新生免疫缺陷CH1-2hSaW41HHH小鼠，3个月后评估嵌合率，感染前1天及之后每5天静脉注射氯膦酸盐脂质体，经眶后注射间日疟原虫感染红细胞，感染后第9天取血和骨髓。
小鼠血和骨髓寄生虫定量与成像
定量感染负荷并鉴定骨髓中感染细胞表型。
提取血和骨髓RNA，逆转录，用pLN-Pm18S质粒标准品进行qPCR检测间日疟原虫18S rRNA；同时用成像流式分析骨髓CD235a+CD71+细胞内DAPI+寄生虫。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取与qRT-PCR | PAXgene稳定化血液采集管 | BD | 12937706 |
| RNA提取 | Mag-Bind总RNA 96试剂盒 | Omega Bio-Tek | M6731-01 |
| KingFisher Flex仪器 | Thermo Scientific | -- | |
| qRT-PCR | SensiFAST一步法预混液 | Bioline | BIO-76005 |
| LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 |
| 抗CD45-FITC抗体 | BioLegend | 368508 | |
| 抗CD71-PE-Vio615抗体 | Miltenyi Biotec | 130-115-036 | |
| BD Symphony A1流式细胞仪 | BD | -- | |
| 成像流式细胞术 | 抗CD235a-AlexaFluor647抗体 | BioLegend | 349130 |
| 抗CD235a-FITC抗体 | Biolegend | 349104 | |
| 抗CD71-AlexaFluor700抗体 | Biolegend | 334130 | |
| ImageStream ISX MkII成像流式细胞仪 | Amnis Corp. | -- | |
| 人源化小鼠构建 | EasySep人CD34阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | 17856 |
| RNA提取 | NucleoZol RNA提取试剂 | Machery-Nagel | 740404.200 |
| NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Machery-Nagel | 740406.50 | |
| 逆转录 | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 18064-022 |
| qPCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725271 |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床分离株流式细胞术 | 样本量（间日疟原虫n=4，恶性疟原虫n=10，间日疟原虫n=3）、Hoechst 33342浓度（16.2 µM）、抗体克隆与货号、采集事件数（≥1×10⁶） 阅读提示：Methods中“Flow cytometric analysis of infected red blood cells from clinical isolates”及Figure 1图注 |
| 人源化HIS-HEry小鼠感染 | CD34+细胞注射量（1.7–1.9×10⁵）、小鼠品系（CH1-2hSaW41HHH）、氯膦酸盐脂质体给药方案（200 µL，感染前1天及之后每5天）、感染红细胞数量（2.5×10⁶–5×10⁶）、感染后取材时间（第9天） 阅读提示：Methods中“Generation of humanized mice (HIS-HEry)”和“Infection of HIS-HEry mice with P. malariae” |
| 小鼠寄生虫定量qPCR | RNA提取试剂盒、逆转录酶、qPCR预混液、质粒标准品浓度范围（5–5×10⁹拷贝/µL）、Cq阳性阈值（<38） 阅读提示：Methods中“Parasite quantification in HIS-HEry mice” |
| 成像流式细胞术 | 抗体组合（CD45-FITC、CD71-PE-Vio615、CD235a-AlexaFluor647或DAPI、CD235a-FITC、CD71-AlexaFluor700）、固定条件（4% PFA/0.075% glutaraldehyde） 阅读提示：Methods中“Imaging flow cytometry”及Supplementary Figures S2–S4 |
| 数学模型校正 | 疟原虫红细胞周期假设（间日疟原虫T=2天，间日疟原虫T=3天）、CD71半衰期范围（0.5–1.6天） 阅读提示：Methods中“Statistical analysis and mathematical modelling”及Figure 2 |