原代人角膜内皮细胞分离与配对培养
建立来自配对供体角膜的原代CEnCs，并在两种培养方案下平行扩增以比较表型稳定性。
从25名供体配对角膜中剥离Descemet–endothelium复合体，经胶原酶A消化分离细胞，接种于胶原IV包被的24孔板，分别采用method 1和method 2培养至传代0–2。
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人角膜内皮细胞扩增过程中标志物表达与表型之间的分离
Divergence Between Marker Expression and Phenotype During Human Corneal Endothelial Cell Expansion
实验完整度
高含原代CEnCs体外培养与配对供体角膜，行形态、RT-qPCR、流式、免疫荧光、ELISA多层级验证
主要模型
原代人角膜内皮细胞（配对供体角膜来源） method 1培养的CEnCs（传代0–2） method 2培养的CEnCs（传代0–2） 离体人角膜内皮组织（ex vivo tissue）
重点核对
供体角膜纳入标准：中央内皮细胞密度（ECD）≥2500 cells/mm²，且无眼病、系统慢性病或传播感染史 细胞接种与培养：每对角膜分离细胞等量接种于4孔胶原IV包被24孔板，分别采用method 1与method 2培养 传代与分析时间点：在传代0、1、2达到约90%汇合状态后进行形态、RT-qPCR、流式、免疫荧光和ELISA检测 method 2关键处理：含10 µM SB203580、1 µM SB431542，且第3天换液后不再补充Y-27632 统计设计：形态学用1因素ANOVA，基因表达、流式和ELISA用2因素ANOVA，流式与离体组织比较用Welch's t-test，P<0.05
摘要
目的：本研究旨在比较两种已建立的原代人角膜内皮细胞（CEnCs）培养方案在连续传代过程中，基于常规标志物的评估是否能充分反映表型稳定性。方法：从25名个体（18–44岁）的配对供体角膜中分离原代CEnCs，并使用2种已建立的方法进行培养。在传代0至2时，使用定量形态学（细胞面积、形状因子、核质比和细胞密度）、内皮相关基因的RT-qPCR、流式细胞术、免疫荧光以及分泌型血小板反应蛋白-2（TSP2）的ELISA定量进行评估。统计比较使用1或2因素方差分析及多重比较（P < 0.05）。结果：与method 2相比，使用method 1培养的CEnCs在连续传代中维持更高的细胞密度、更小的细胞面积和更高的六角形比例（P < 0.01至P < 0.0001）。相反，在后期传代中，method 2中选定的内皮相关标志物（ATP1A1和TJP1）的转录水平以及ZO-1蛋白表达更高（P < 0.01），尽管形态学进行性恶化且膜定位丧失。与CEnC表型丧失相关的蛋白（CD44和CD10）在method 2中显著升高（P < 0.05至P < 0.0001），且传代2时TSP2分泌增加（P < 0.001）。在两种方法中，与原生组织相比，大多数经典内皮基因下调≥75%。结论：尽管经典内皮标志物表达得以保留，CEnCs中仍可发生培养诱导的表型漂移。标志物表达、形态学、定位和内皮-间质转化（EndMT）读数之间的分离凸显了仅基于标志物评估的局限性。整合的多维表型分析应指导培养CEnCs的评估和扩增方案的优化，尽管需要功能验证将这些读数与内皮性能联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在两种已建立的原代人角膜内皮细胞培养方案连续传代过程中，基于常规标志物的评估是否能充分反映表型稳定性？
- 核心机制
- 培养条件可诱导CEnCs发生进行性表型漂移，表现为形态学恶化、标志物膜定位丧失和EndMT相关标志物升高，而部分经典内皮标志物表达仍可保留，导致标志物表达与表型分离。
- 主要证据
- 使用25名供体配对角膜来源的原代CEnCs，在传代0–2中通过定量形态学、RT-qPCR、流式细胞术、免疫荧光和TSP2 ELISA比较method 1与method 2；method 1维持更接近离体组织的形态，而method 2后期传代中TJP1/ATP1A1和ZO-1表达更高但膜定位丧失，CD10、CD44和TSP2升高。
- 研究意义
- 研究结果提示，仅基于经典标志物表达评估培养CEnCs可能忽略表型漂移；支持采用整合的多维表型分析策略评估培养CEnCs并指导扩增方案优化，但需功能验证将这些读数与内皮性能联系起来。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
两种培养方案的连续传代扩增
比较method 1与method 2在连续传代中对CEnC形态和表型稳定性的影响。
method 1先使用stabilization medium，24小时后切换至增殖培养基，达到约90%汇合后转入M5稳定培养基至少7天；method 2使用Opti-MEM基础培养基，第3天换液后加入SB203580和SB431542并停止Y-27632。
形态学定量与传代监测
评估两种培养方案在传代过程中细胞形态、六角形比例、核质比和细胞密度是否接近离体人角膜内皮。
在传代0、1、2达到约90%汇合后采集明场图像，使用CellProfiler定量细胞面积、形状因子、核质比和细胞密度，并与离体组织比较。
内皮与EndMT标志物表达检测
检测两种培养方案中经典内皮标志物和EndMT相关标志物在转录及蛋白水平的变化。
在传代0、1、2收集汇合细胞，进行RT-qPCR检测ACT2、ALCAM、ATP1A1、CD44、MME、NCAM1、SLC4A4、SLC4A11、TJP1等基因；流式细胞术检测CD166、Na⁺/K⁺-ATPase、ZO-1、CD56、CD10、CD44、CD140a、ki67、α-SMA等；免疫荧光检测标志物表达与定位。
分泌型TSP2定量
评估培养上清中TSP2水平是否与EndMT相关表型漂移相符。
在传代0、1、2汇合培养时收集培养上清，使用human thrombospondin-2 DuoSet ELISA检测TSP2浓度，并以总蛋白归一化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | 真空打孔块 | Janach | -- |
| 10毫米直径角膜环钻 | Janach | -- | |
| DMEK剥离钩 | Janach | -- | |
| 台盼蓝 | -- | -- | |
| Hanks平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胶原酶A | Roche | -- | |
| Opti-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Capricorn Scientific | -- | |
| 硫酸软骨素 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | -- | |
| 庆大霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TrypLE Express消化液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | IV型胶原（人胎盘来源） | Sigma-Aldrich | -- |
| 人内皮无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| ROCK抑制剂Y-27632 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Ham's F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| M199培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | -- | |
| SB203580 | Calbiochem | -- | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | -- | |
| 明场成像 | CKX53倒置显微镜 | Olympus; Evident Europe GmbH | -- |
| Motic相机 | Motic | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 小鼠单克隆抗CD166抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 小鼠单克隆抗ZO-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 兔多克隆抗Na⁺/K⁺-ATPase α1抗体 | Proteintech | -- | |
| 小鼠单克隆抗CD44抗体 | Abcam | -- | |
| 兔多克隆抗CD10抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 兔单克隆抗α-SMA抗体 | Abcam | -- | |
| 小鼠单克隆抗CD56抗体 | Invitrogen | -- | |
| 兔多克隆抗SLC4A4抗体 | Invitrogen | -- | |
| 兔多克隆抗SLC4A11抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 小鼠单克隆抗PDGFRα抗体 | BioLegend | -- | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Merck | -- | |
| 免疫荧光成像 | Eclipse Ti-E倒置显微镜 | Nikon | -- |
| X-Light V2-TP转盘共聚焦单元 | CrestOptics S.p.A. | -- | |
| 流式细胞术 | Zombie NIR | BioLegend | 423105 |
| NCAM1 PE-Cy5 | BioLegend | 304608 | |
| CD10 BV605 | BioLegend | 312222 | |
| CD166 BV785 | BioLegend | 343928 | |
| CD140a PE-Cy7 | BioLegend | 323508 | |
| CD44 BV421 | BioLegend | 338810 | |
| CD144 PE-Dazzle 594 | BioLegend | 348520 | |
| Na⁺/K⁺-ATPase α1 AF488 | Sigma-Aldrich | 16–243 | |
| ZO-1 AF555 | Thermo Fisher Scientific | 740002MP555 | |
| α-SMA AF647 | BioLegend | 614856 | |
| ki-67 BV510 | BioLegend | 350518 | |
| Aurora 4激光流式细胞仪 | Cytek Bio | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BioDrop µLITE+分光光度计 | Biochrom | -- | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| iQ SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| Bio-Rad CFX96 Touch实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | 人血小板反应蛋白-2 DuoSet | R&D Systems | DY1635 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nunc Maxisorp 96孔板 | Nunc | -- | |
| 超灵敏TMB溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Clariostar酶标仪 | BMG LABTECH | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 供体角膜纳入与分配 | 供体年龄18–44岁、中央ECD ≥2500 cells/mm²、无眼病/系统慢性病/传播感染史、Optisol-GS 4°C保存≤14天；Table 1列出25名供体及实验分配 阅读提示：Materials and Methods “Research-Grade Donor Human Corneas and Ethical Statement”及Table 1 |
| 原代CEnC分离与接种 | Descemet–endothelium复合体手动剥离，1 mg/mL collagenase A 37°C消化2–7小时，每30分钟评估，TrypLE Express 5–10分钟后接种于胶原IV包被24孔板；每对供体细胞等量接种4孔 阅读提示：Materials and Methods “Isolation of Primary Human Corneal Endothelial Cells” |
| method 1培养条件 | 初始stabilization medium成分及24小时后切换至增殖培养基；增殖培养基含5% FBS、20 µg/mL ascorbic acid、1× ITS、10 ng/mL FGF-2、10 µM Y-27632；约90%汇合（8–10天）后转入M5稳定培养基至少7天 阅读提示：Materials and Methods “Culture of Primary Corneal Endothelial Cells With Method 1” |
| method 2培养条件 | Opti-MEM含8% FBS、200 mg/L calcium chloride、0.08% chondroitin sulfate、50 µg/mL gentamicin、5 ng/mL EGF、20 µg/mL ascorbic acid、10 µM Y-27632；第3天换液后加入10 µM SB203580和1 µM SB431542且不再补充Y-27632 阅读提示：Materials and Methods “Culture of Primary Corneal Endothelial Cells With Method 2” |
| 传代分析时间点与检测终点 | 传代0、1、2，达到约90%汇合且无大面积无细胞区域后检测；形态学、RT-qPCR、流式、免疫荧光和ELISA均在此条件下进行；免疫荧光使用4名供体培养细胞和n=9离体复合体 阅读提示：Materials and Methods中“Brightfield Imaging”“Immunofluorescence”“Flow Cytometry”“Real Time-qPCR”“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”及相关Figure legends |
| 统计分析与重复 | 数据表示为mean ± SD；形态学用1因素ANOVA，基因表达、流式和ELISA用2因素ANOVA，流式与离体组织比较用Welch's t-test，P<0.05；RT-qPCR每条件三次独立实验且每样本三个技术重复；ELISA样品双复孔、每板2条标准曲线 阅读提示：Materials and Methods “Statistical Analysis”、各方法小节及Figure legends |