Surveying alternative transcripts of disease-associated genes and their cell type specificity - a case study with ANK3
包含人/小鼠脑组织纳米孔全长测序、小鼠脑细胞核FACS分选及ddPCR细胞类型特异性表达验证，具备多层次独立证据和机制验证。
人脑胼胝体和额叶组织 小鼠脑皮层组织 小鼠脑细胞核分选模型（NeuN+神经元、Olig2+少突胶质细胞、SOX9+星形胶质细胞）
使用Oxford Nanopore MinION对人和小鼠ANK3全长转录本进行测序，测序深度和读长覆盖可变剪接区域 小鼠脑皮层组织经Singulator 100 System分离细胞核，50–100 mg组织用量，0.2 U/mL RNase抑制剂，0.04% Triton X-100 FACS分选使用anti-NeuN-AF488、anti-Olig2-AF647、anti-SOX9-PE抗体，1:100 DAPI染色，分选纯度神经元和少突胶质细胞>95% ddPCR测量Ank3异构体表达，以Top1为参考基因，每个Ank3异构体在星形胶质细胞中仅4个重复，其他细胞类型8个生物学重复 统计采用limma包进行差异表达分析，FDR<0.01
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定ANK3所有可变剪接外显子及异构体组合，并评估小鼠与人类之间的保守性。
从人胼胝体和额叶以及小鼠相同脑区提取RNA，使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit合成cDNA，经UltraRun LongRange PCR Kit扩增（延伸13分钟），使用TSS1或TSS2引物进行ANK3特异性扩增，产物经Agilent DNA 12000试剂盒分析后，使用Oxford Nanopore MinION进行测序，Fast5文件经GPU-Guppy碱基识别，使用minimap2比对到GRCh38，并使用FLAIR进行异构体分析。
分离神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的细胞核，用于细胞类型特异性表达分析。
取成年小鼠皮层组织，使用Singulator 100 System和Singulator Nuclei Isolation Kit分离细胞核，免疫染色后使用FACSMelody细胞分选仪分选NeuN+、Olig2+、SOX9+和SOX9-细胞核群。
准确定量可变剪接外显子在不同脑细胞类型中的表达水平。
从分选细胞核中提取RNA，合成cDNA，使用针对Gfap、Sox9、Top1和Ank3异构体的引物和探针进行ddPCR反应，以Top1为参考基因进行标准化。
选择稳定表达的参考基因用于跨细胞类型表达比较。
使用小鼠额叶皮层RNAseq数据（n=16内部数据，n=86已发表数据）分析参考基因表达稳定性，筛选与Ank3表达水平相似且变异低的基因，最终选择Top1，并计算细胞类型调整因子进行标准化。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | QIAGEN | #74136 |
| cDNA合成 | SMARTer PCR cDNA合成试剂盒 | TakaraBio | -- |
| 长距离PCR扩增 | UltraRun LongRange PCR试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 测序 | SQK-LSK109连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore | -- |
| EXP-NBD196天然条形码试剂盒 | Oxford Nanopore | -- | |
| R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore | -- | |
| EXP-FLP002流动池引发试剂盒 | Oxford Nanopore | -- | |
| MinION Mk1C测序仪 | Oxford Nanopore | -- | |
| DNA片段分析 | Agilent DNA 12000试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| DNA纯化 | Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞核分离 | Singulator 100系统 | S2 Genomics | -- |
| Singulator细胞核分离试剂盒 | S2 Genomics | #100-060-817 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | Invitrogen | #10777-019 | |
| 细胞核储存试剂 | S2 Genomics | #100-063-405 or #100-063-623 | |
| 细胞核计数 | NucleoCassette计数板 | ChemoMetec | #941-0001 |
| NucleoCounter NC-200细胞核计数器 | ChemoMetec | -- | |
| 免疫染色 | SYTO9绿色荧光核酸染料 | Invitrogen | #S34854 |
| DAPI | ThermoFisher | #62248 | |
| dPBS（无Ca2+，无Mg2+） | Sigma-Aldrich | #14190144 | |
| 抗NeuN-AF488抗体 | -- | -- | |
| 抗Olig2-AF647抗体 | -- | -- | |
| 抗SOX9-PE抗体 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Micro试剂盒 | Qiagen | #74004 |
| RNA完整性分析 | RNA Pico芯片 | Agilent Technologies | #5067-1513 |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | #4368814 |
| ddPCR | ddPCR探针预混液（无dUTP） | Bio-Rad | -- |
| QX200 AutoDG微滴生成仪 | Bio-Rad | -- | |
| QX200微滴读取仪 | Bio-Rad | -- | |
| 流式分选 | FACSMelody细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Nanopore全长转录本测序 | RNA来源脑区（人胼胝体和额叶，小鼠相同脑区），ANK3特异性扩增引物（TSS1或TSS2与共同反向引物），延伸时间13分钟，28个循环，测序平台MinION Mk1C快速模式72小时 阅读提示：Methods中Sequencing of full-length human and mouse ANK3 transcripts小节，Fig. 2b和Table S1 |
| 小鼠脑细胞核分离与FACS分选 | 小鼠品系C57BL/6，2–4月龄，皮层组织50–100 mg，抗体组合（anti-NeuN-AF488、anti-Olig2-AF647、anti-SOX9-PE），1:100 DAPI，染色45分钟，分选纯度验证 阅读提示：Methods中Nuclei isolation and flow cytometric sorting小节，Fig. 3，Table S5和S6 |
| ddPCR表达定量 | RNA提取试剂盒RNeasy Plus Micro，RIN>7.0，cDNA合成4.4 ng，ddPCR使用1 ng RNA，参考基因Top1及其细胞类型调整，重复数（8个生物学重复，星形胶质细胞4个） 阅读提示：Methods中Expression by droplet digital PCR小节，Fig. 2d，Table S7–S8和S11–S13 |
| 参考基因稳定性分析与标准化 | 使用Top1作为参考基因，需根据细胞类型调整，调整因子计算基于每个细胞类型中Top1表达中位数，统计分析使用limma包和FDR<0.01 阅读提示：Methods中Reference gene expression stability in mouse cortex和Top1 reference gene adjustment and normalization小节，Fig. S10–S11，Table S9–S10和S12–S13 |
