9q34.13位点精细定位
鉴定黑色素瘤风险位点的潜在因果变异
使用SuSiE、DAP-G和RSparsePro对rs3780269±500 Kb区域进行贝叶斯精细定位，结合LLR和LD扩展分析
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
9q34.13位点的功能特征鉴定表明RAPGEF1是通过RAS激活调节黑色素瘤和痣风险的候选基因
Functional characterization of the 9q34.13 locus identifies RAPGEF1 as a candidate gene modulating risk for melanoma and nevi via RAS activation
实验完整度
高包含黑色素细胞体外模型、CRISPRi/shRNA功能验证、RAS/RAP1激活机制验证、斑马鱼体内模型及六个患者肿瘤队列分析
主要模型
人原代黑色素细胞培养物 永生化人黑色素细胞C283T 永生化人黑色素细胞p'mel Tg(mitfa:BRAF p.Val600Glu); p53(lf); mitfa(lf)斑马鱼模型
重点核对
RAPGEF1 shRNA敲低后通过结晶紫染色和BrdU流式检测黑色素细胞增殖变化 多西环素诱导RAPGEF1过表达（0.2 μg/ml）后检测黑色素细胞生长 p'mel细胞中RAPGEF1过表达联合BRAF p.Val600Glu的软琼脂集落形成实验 无血清培养24小时后50 ng/ml人EGF刺激下RAP1和RAS激活的pull-down检测 六个黑色素瘤队列中RAPGEF1表达与BRAF/NRAS突变状态的线性回归分析
摘要
全基因组关联研究在染色体9q34.13带鉴定出一个与黑色素瘤和痣计数相关的位点。精细定位和黑色素细胞表达数据共同提示两个潜在的风险基因，它们与风险呈相反的关联：Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子1（RAPGEF1）水平较高和尿苷-胞苷激酶1（UCK1）水平较低。共定位分析和条件TWAS提示多个因果顺式调控序列变异彼此处于部分连锁不平衡（LD）。黑色素细胞capture-HiC和CRISPR抑制证明精细定位变异与RAPGEF1和UCK1启动子之间存在调控相互作用。聚焦于RAPGEF1，我们证明RAPGEF1表达促进黑色素细胞生长并驱动人永生化黑色素细胞的集落形成。在人EGF处理后，RAPGEF1过表达激活了RAP1和RAS。此外，我们发现RAPGEF1表达在缺乏强激活RAS-MAPK通路突变的黑色素瘤中显著富集，提示RAPGEF1可能促进黑色素瘤中致癌性RAS-MAPK通路信号传导。此外，在这些肿瘤中，我们提供初步证据支持RAPGEF1表达在缺乏RAS或BRAF突变的个体中的预后相关性。结合其他近期研究，这些数据提示影响RAS激活的种系变异可能在痣发育和黑色素瘤风险中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 9q34.13位点的因果变异和靶基因是什么，它们如何影响黑色素瘤和痣的风险？
- 核心机制
- 风险等位基因通过顺式调控变异上调RAPGEF1表达，RAPGEF1促进RAP1和RAS激活，进而驱动黑色素细胞异常增殖和存活。
- 主要证据
- 黑色素细胞eQTL/TWAS、capture-HiC和CRISPRi证实变异调控RAPGEF1和UCK1；RAPGEF1敲低降低黑色素细胞增殖，过表达增强生长和软琼脂集落形成；RAPGEF1过表达在EGF刺激下激活RAP1和RAS；六个黑色素瘤队列中RAPGEF1在RAS-MAPK野生型肿瘤中表达升高。
- 研究意义
- 提示影响RAS激活的种系变异可能在痣发育和黑色素瘤风险中发挥关键作用，RAPGEF1可能作为缺乏强激活RAS-MAPK突变的黑色素瘤的预后标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选变异的表观基因组注释
评估精细定位变异是否位于黑色素细胞调控元件
使用BedtoolsR将变异与黑色素细胞和黑色素瘤染色质状态、ATAC-seq峰和DHS重叠
变异等位基因转录活性评估
检测精细定位变异是否具有等位基因特异性调控活性
使用MPRA在永生化原代黑色素细胞和UACC903黑色素瘤细胞中评估变异等位基因对转录活性的影响
变异-基因物理互作映射
将风险变异与靶基因启动子关联
在5个独立原代黑色素细胞培养物中进行capture-HiC，使用CHiCAGO检测染色质相互作用
CRISPRi验证顺式调控
验证风险区域对RAPGEF1和UCK1转录的调控作用
在稳定表达dCas9-KRAB的C283T永生化黑色素细胞中，使用靶向变异侧翼区域的gRNA进行CRISPRi，通过TaqMan qRT-PCR检测RAPGEF1和UCK1 mRNA水平
RAPGEF1和UCK1功能验证
评估RAPGEF1和UCK1表达对黑色素细胞增殖的影响
使用shRNA敲低RAPGEF1或UCK1，通过结晶紫染色和BrdU流式检测细胞增殖；使用多西环素诱导系统过表达RAPGEF1，检测细胞生长
RAPGEF1过表达与集落形成
评估RAPGEF1是否促进锚定非依赖性生长
在表达BRAF p.Val600Glu的p'mel细胞中过表达RAPGEF1、NRAS突变体、RAP1A或RAP1A突变体，进行软琼脂集落形成实验
RAP1和RAS激活检测
验证RAPGEF1过表达是否激活RAP1和RAS
在C283T黑色素细胞中多西环素诱导RAPGEF1过表达，无血清培养24小时后用50 ng/ml人EGF刺激，使用RalGDS-RBD beads pull-down检测RAP1激活，Raf-RBD beads pull-down检测RAS激活，Western blot检测AKT和ERK磷酸化
斑马鱼体内验证
评估RAPGEF1在体内是否促进黑色素瘤发生
使用miniCoopR系统在Tg(mitfa:BRAF p.Val600Glu); p53(lf); mitfa(lf)斑马鱼中过表达人RAPGEF1或空载体对照，监测癌前病变区和肿瘤发生；使用MAZERATI系统递送BRAF p.Val600Glu/p53(lf)或RAPGEF1/p53(lf)，观察肿瘤发生
肿瘤队列中RAPGEF1表达分析
评估RAPGEF1表达与RAS-MAPK突变状态及预后的关联
分析TCGA、Leeds、Lund、Liu、Van Allen和Riaz六个黑色素瘤队列中RAPGEF1表达与BRAF/NRAS等驱动突变状态的关系，并进行生存分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因组精细定位与关联分析
表观基因组与染色质互作分析
肿瘤队列数据与生存分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 黑色素细胞培养 | 真皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-200-030 |
| 黑色素细胞生长添加剂 | ATCC | PCS-200-041 | |
| 两性霉素B/青霉素/链霉素 | Quality Biological | 120-096-711 | |
| 支原体检测 | MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-710 |
| small RNA测序 | miRNeasy试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| NEB Next小RNA文库构建试剂盒 | NEB | E7330s | |
| CRISPRi | pLX_311-KRAB-dCas9质粒 | Addgene | 96918 |
| pXPR-050质粒 | Addgene | 96925 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript IV VILO预混液 | Thermo Scientific | -- |
| shRNA敲低 | RAPGEF1 shRNA TRCN0000048129 | Sigma | TRCN0000048129 |
| RAPGEF1 shRNA TRCN0000048130 | Sigma | TRCN0000048130 | |
| UCK1 shRNA TRCN0000037763 | Sigma | TRCN0000037763 | |
| UCK1 shRNA TRCN0000199254 | Sigma | TRCN0000199254 | |
| RAPGEF1过表达 | pLX304质粒 | Addgene | 25890 |
| pCW57.1质粒 | Addgene | 41393 | |
| 病毒浓缩 | Vivaspin浓缩器 | VWR | 76409-072 |
| RAPGEF1过表达 | RAPGEF1 cDNA构建体OHS5893-202500127 | Horizon Discovery | OHS5893-202500127 |
| 细胞增殖检测 | BrdU流式检测试剂盒 | BD Pharmingen | -- |
| 流式分析 | AttuneNxT流式细胞仪 | Thermo Scientific | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| 4–12% Bis-Tris预制胶 | Invitrogen | -- | |
| 抗RAPGEF1抗体MA5-26281 | ThermoScientific | MA5-26281 | |
| 抗RAS抗体05-516 | Sigma | 05-516 | |
| 抗RAP1抗体ab181858 | Abcam | ab181858 | |
| 抗磷酸化ERK抗体9106S | Cell Signaling Technology | 9106S | |
| 抗Pan-AKT抗体2920s | Cell Signaling Technology | 2920s | |
| 抗总ERK抗体4695s | Cell Signaling Technology | 4695s | |
| 抗磷酸化AKT抗体4060s | Cell Signaling Technology | 4060s | |
| 抗β-actin抗体A5316 | Sigma | A5316 | |
| 集落形成实验 | SeaKem LE琼脂糖 | Lonza | -- |
| 集落成像 | Lionheart成像仪 | Agilent | -- |
| RAP1激活检测 | RAP1激活检测试剂盒ab212011 | Abcam | ab212011 |
| RAS激活检测 | GST融合Raf-1 RBD磁珠 | Sigma | 14863 |
| RAF-RBD蛋白GST磁珠 | Cytoskeleton | RF02-A | |
| RAP1/RAS激活刺激 | 人EGF蛋白 | R&D | 236-EG-200 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 黑色素细胞培养与模型 | 原代黑色素细胞来源（新生儿包皮）、培养基（Dermal Cell Basal Medium + Melanocyte Growth Kit + 1%两性霉素B/青霉素/链霉素）、C283T和p'mel细胞的培养条件、支原体检测 阅读提示：Materials and Methods中Cell culture小节 |
| CRISPRi验证调控 | gRNA序列（Table S1）、靶向变异位置（±50 bp）、非靶向对照gRNA（NTC1、NTC2）、dCas9-KRAB表达验证、嘌呤霉素浓度（1.5 μg/mL）、10个生物学重复、qPCR三技术重复 阅读提示：Materials and Methods中CRISPRi validation小节及Table S1 |
| RAPGEF1过表达与增殖 | 多西环素浓度（0.2 μg/ml）、 blasticidin选择浓度（5-10 μg/ml）、嘌呤霉素选择浓度（1-2 μg/ml）、结晶紫定量（OD560）、BrdU标记浓度（10 μM）和时间（1-3小时） 阅读提示：Materials and Methods中Overexpression和Cell proliferation assays小节 |
| 集落形成实验 | 细胞接种数（5000/孔）、琼脂糖浓度（底层0.65%、顶层0.4%）、培养基（HAMF12 + 10% FBS）、集落计数时间（4-6周）、集落大小阈值（>70 μm）、每条件6孔 阅读提示：Materials and Methods中Colony formation assays小节 |
| RAP1和RAS激活检测 | 无血清培养时间（24小时）、人EGF浓度（50 ng/ml）、刺激时间点（2、5、15分钟）、pull-down beads类型（RalGDS-RBD、Raf-RBD）、Western blot抗体 阅读提示：Materials and Methods中RAP1 and RAS activation assay小节及Figure 4 legend |
| 斑马鱼体内实验 | 斑马鱼品系（Tg(mitfa:BRAF p.Val600Glu); p53(lf); mitfa(lf)）、RAPGEF1队列n=35、MCS对照n=48、监测时间（13-46周）、CPZ定义标准、MAZERATI系统质粒注射 阅读提示：Materials and Methods中Zebrafish Melanoma Generation and Analysis小节 |
| 肿瘤队列分析 | 各队列样本量（TCGA n=363、Leeds n=503、Lund n=146、Liu n=84、Van Allen n=38、Riaz n=39）、RAPGEF1表达检测平台、突变分类模型（Model 1-5）、协变量（年龄、性别、肿瘤纯度、分期）、生存分析中位数二分类 阅读提示：Materials and Methods中Tumor cohort descriptions和Assessing RAPGEF1 expression association小节及Tables S2-S8 |