PBMC分离与转录组测序
获取GO患者和健康对照者PBMCs的转录组图谱，为差异表达分析提供数据。
采集空腹GO患者和HCs外周静脉血，使用Lymphoprep密度梯度离心分离PBMCs，提取RNA后在DNBSEQ平台进行bulk RNA测序。
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Graves眼病发生与进展中生物标志物的鉴定与验证
Identification and Validation of Biomarkers in the Development and Progression of Graves' Ophthalmopathy
实验完整度
高包含PBMC bulk RNA测序、独立qRT-PCR队列验证及流式细胞术蛋白验证，涉及差异表达、WGCNA、免疫浸润和ROC分析，并有治疗前后配对样本。
主要模型
GO患者外周血单个核细胞（PBMCs） 健康对照者PBMCs qRT-PCR验证队列（64例GO患者和18例HCs） 流式细胞术验证队列（32例GO患者和6例HCs）
重点核对
测序队列样本量：16例GO患者和6例健康对照 qRT-PCR验证队列：64例GO患者和18例HCs，分为轻度25例、中重度29例、重度10例 流式细胞术验证队列：32例GO患者和6例HCs，分为轻度16例、中重度9例、重度7例 免疫抑制治疗前后配对样本：9例治疗有效的GO患者 DEGs筛选阈值：|fold change| > 1.5且Padj < 0.05；GSEA阈值：|NES| > 1.5且Padj < 0.05
摘要
目的：Graves眼病（GO）是Graves病最常见的甲状腺外表现。本研究旨在鉴定参与GO发病机制的免疫相关基因，并评估其作为外周血生物标志物用于早期诊断和疾病严重程度评估的潜力。方法：对16例GO患者和6例健康对照者的外周血单个核细胞进行bulk RNA测序。进行了差异表达分析、功能富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和免疫浸润分析。关键基因在独立队列中通过定量实时PCR和流式细胞术进行验证。结果：共鉴定出2858个差异表达基因（DEGs），在免疫相关通路中显著富集。整合DEGs、WGCNA模块和通路分析，鉴定出90个候选核心基因。其中，XAF1、SAMD9L和CD2对GO显示出高诊断准确性。值得注意的是，仅CX3CR1和IL-7R的表达与疾病严重程度显著相关；IL-7R在治疗有效的患者接受免疫抑制治疗后显著下调。流式细胞术证实，CD4+ T细胞和记忆B细胞中的IL-7R表达与GO严重程度呈正相关。结论：本研究鉴定出IL-7R和CX3CR1作为GO中新的严重程度相关生物标志物，为其免疫发病机制提供了见解，并为诊断、预后和治疗提供了潜在的外周血靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定参与Graves眼病发病机制的免疫相关基因，并评估其作为外周血生物标志物用于早期诊断和疾病严重程度评估的潜力。
- 核心机制
- IL-7R和CX3CR1参与GO的免疫发病机制；IL-7R表达与疾病严重程度正相关，并在免疫抑制治疗后下调，提示IL-7/IL-7R轴可能促进致病性T细胞和记忆B细胞的存活与持续活化。
- 主要证据
- PBMC bulk RNA测序鉴定出2858个DEGs和90个候选核心基因；qRT-PCR在独立队列中验证CX3CR1、STAT1、IL-7R等基因表达升高（P < 0.01）；IL-7R与EUGOGO严重程度（R = 0.493, P < 0.001）和EOM体积（R = 0.286, P = 0.022）正相关；9例治疗有效患者免疫抑制治疗后IL-7R显著下调（P = 0.012）；流式细胞术证实CD4+ T细胞和记忆B细胞中IL-7R表达与严重程度正相关。
- 研究意义
- 将IL-7R和CX3CR1确定为GO新的严重程度相关生物标志物，增进了对GO免疫病理机制的理解，并为开发基于外周血的诊断工具和靶向治疗策略提供了潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异表达与功能富集分析
鉴定GO与HCs之间的差异表达基因及其富集的生物学通路。
使用DESeq2进行差异表达分析，ClusterProfiler进行GO富集分析，GSEA使用Hallmark、C2、C5和C7基因集进行通路富集分析。
WGCNA共表达网络分析
鉴定与GO状态和严重程度相关的共表达模块及核心基因。
基于FPKM矩阵选取变异最大的前20%基因构建加权基因共表达网络，计算软阈值，构建邻接矩阵和TOM，识别共表达模块，并与GO状态和严重程度进行相关性分析，筛选核心基因。
免疫浸润分析
评估GO患者PBMCs中免疫细胞亚群的浸润水平及其与核心基因的相关性。
使用ssGSEA算法基于TISIDB基因签名量化28种免疫细胞类型的相对富集分数，计算免疫细胞间及核心基因与免疫细胞间的Spearman相关系数。
qRT-PCR验证核心基因表达
在独立队列中验证核心基因的mRNA表达水平及其与疾病严重程度的相关性。
PBMCs接种于12孔板，培养6小时后提取总RNA，逆转录合成cDNA，使用SYBR Green进行qRT-PCR，以β-actin为内参，计算相对表达量。
流式细胞术检测IL-7R表达
在蛋白水平验证IL-7R在GO患者PBMC亚群中的表达及其与疾病严重程度的关系。
PBMCs重悬于RPMI-1640 + 10% FBS，接种于48孔板，使用荧光标记抗体染色，在BD FACS Canto II流式细胞仪上采集数据，FlowJo分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和记忆B细胞中CD127+细胞比例。
治疗前后IL-7R表达变化分析
评估免疫抑制治疗对核心基因表达的影响。
对9例接受静脉甲泼尼龙联合吗替麦考酚酯治疗且治疗有效的GO患者，比较治疗前后IL-7R、STAT1、IRF2和CX3CR1的mRNA表达水平。
诊断效能ROC分析
评估核心基因区分GO与HCs以及区分重度与非重度GO的诊断准确性。
使用ROC曲线分析评估各基因的AUC值、95%置信区间和P值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | Lymphoprep | Stemcell Technologies | -- |
| RNA测序 | DNBSEQ平台 | Bgi Genomics Co., Ltd. | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Mabio | -- |
| RNA浓度测定 | 分光光度计 | DeNovix Inc. | -- |
| cDNA合成 | HiScript II Q RT SuperMix for qRT-PCR | Vazyme Biotech | -- |
| qRT-PCR | ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech | -- |
| Bio-Rad实时PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | APC-Cy7标记的可固定活力染料740 | Starter | S0D0022 |
| FITC CD3 | BD Bioscience | 555339 | |
| BV510 CD8 | BD Bioscience | 563256 | |
| BV510 CD19 | BD Bioscience | 562947 | |
| AF647 CD27 | Starter Biotechnology | S0B1821 | |
| PE CD38 | BD Bioscience | 555460 | |
| BV421 CD127 | BD Bioscience | 562436 | |
| BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC分离与RNA测序 | 测序队列样本量：16例GO患者和6例HCs；PBMC分离方法：Lymphoprep密度梯度离心；测序平台：DNBSEQ 阅读提示：Methods中'PBMC Isolation and RNA Sequencing'小节及Table 1 |
| qRT-PCR验证 | 验证队列样本量：64例GO患者和18例HCs；细胞培养条件：RPMI-1640 + 10% FBS，6小时，5 × 10⁶细胞/孔；内参基因：β-actin；引物序列见Table 2 阅读提示：Methods中'RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR'小节及Table 2 |
| 流式细胞术验证 | 流式验证队列样本量：32例GO患者和6例HCs；细胞数：1–2 × 10⁶细胞/孔；抗体组合及品牌货号；分析软件FlowJo version 10.8.1 阅读提示：Methods中'Flow Cytometry'小节及Figure 8图注 |
| 免疫抑制治疗前后配对分析 | 样本量：9例治疗有效的GO患者；治疗药物：静脉甲泼尼龙联合吗替麦考酚酯；统计方法：配对Wilcoxon符号秩检验 阅读提示：Results中'Validation of Core Genes in GO Patients'小节及Figure 6e–h图注 |
| 疾病严重程度分组 | 分组标准：2021 EUGOGO指南；qRT-PCR队列分组：轻度25例、中重度29例、重度10例；流式队列分组：轻度16例、中重度9例、重度7例 阅读提示：Methods中'Patient Enrollment'小节及Table 1 |