新鲜精液特征比较
比较公驴与种公马新鲜精液的体积、浓度和运动学参数差异
采集公驴和种公马精液，使用CASA分析运动学参数，记录无胶体积和精子浓度
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驴与种公马精液保存的比较：卵黄浆、精浆和稀释液对精子活力、MALDI图谱和生育力的影响
Comparison of donkey and stallion semen preservation: effects of egg yolk plasma, seminal plasma and extenders on sperm motility, MALDI profiles and fertility
实验完整度
高包含体外精子功能检测、MALDI-TOF分子谱分析和体内人工授精生育力验证多个独立证据层级。
主要模型
GNB公驴精液 Welsh种公马精液 GNB母驴人工授精
重点核对
公驴和种公马精液在INRA96、BotuSemen Gold、Beyond三种稀释液中4°C保存24小时后的总活力和前向活力 INRA96中添加0%、2.5%、5%、10% EYP对4°C保存24小时后精子总活力的影响 简单离心（15 min, 600 g, 20°C）或单层胶体离心（SLC, 20 min, 400 g, 20°C）去除精浆后的精子总活力 低体积深部子宫内授精（200 million精子/0.5 mL）新鲜精液、4°C保存24小时精液（含或不含5% EYP）的受胎率 MALDI-TOF质谱分析中公驴和种公马精子肽型和蛋白型谱随保存时间（0、1、3、6、24、48 h）和EYP浓度（0、2.5、5、10%）的变化
摘要
保护濒临灭绝的驴品种需要开发和优化精液保存与人工授精策略，以提高繁殖效率、增加遗传多样性并支持可持续的种群管理。本研究以种公马精液作为参照，评估了商业稀释液（INRA96、BotuSemen Gold、Beyond）、精浆（SP）去除以及卵黄浆（EYP；0–10%）补充对公驴精液在4°C保存24–48小时的影响。使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子活力，而完整细胞MALDI-TOF质谱（ICM-MS）用于表征肽型和蛋白型谱。在低体积深部子宫内授精后评估生育力。在所测试的保存策略中，基于乳蛋白的稀释液INRA96、SP去除和补充5% EYP在保存期间最有效地保持了精子活力。在4°C保存24小时后，补充EYP的精液表现出更高的总活力和前向活力，并达到35%的受胎率，而不含EYP保存的精液为5%（新鲜精液：45%）。这些功能改善伴随着精子蛋白质组的动态重塑，EYP主要减轻冷却引起的分子改变，而不是改变公驴和种公马的基础精子蛋白质组。从保存24小时的精液产下四头Grand Noir du Berry（GNB）驹，为该保存策略提供了体内验证，并突出了其支持辅助生殖和驴种群遗传多样性管理的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何优化公驴精液冷却保存方案以维持精子活力和生育力，并与种公马精液进行比较？
- 核心机制
- EYP主要通过减轻冷却诱导的分子改变而非改变基础精子蛋白质组来保护精子，其保护作用可能与LDL和BSP蛋白相互作用从而稳定精子膜有关；精浆去除可减轻SP成分对冷却精子的有害影响。
- 主要证据
- 在公驴精液中，INRA96补充5%或10% EYP后4°C保存24小时总活力达69±5%，显著高于无EYP对照的36±5%；补充5% EYP的精液人工授精受胎率为35%（7/20），显著高于无EYP保存精液的5%（1/20），与新鲜精液的45%（9/20）无显著差异；产下四头GNB驹。MALDI-TOF分析显示保存时间是精子蛋白型/肽型谱变异的主要来源，EYP主要减轻冷却诱导的分子改变。
- 研究意义
- 为驴品种辅助生殖和遗传多样性保护提供了优化的精液冷却保存策略，并证明低体积深部子宫内授精可减少每次授精的精子数量和体积。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
商业稀释液比较
评估三种商业稀释液对公驴和种公马精液4°C保存24小时后精子活力的影响
精液在35°C下稀释于INRA96、BotuSemen Gold或Beyond中至20×10^6精子/mL，缓慢冷却至4°C，在T0、T1、T3、T6、T24和T48评估精子质量参数
EYP浓度优化
确定INRA96中EYP的最佳补充浓度以维持公驴和种公马精子活力
INRA96补充0%、2.5%、5%和10% EYP，精液4°C保存48小时，在T0、T1、T3、T6、T24和T48评估总活力
精浆去除效果评估
评估精浆去除方式（简单离心或SLC）对4°C保存24小时后精子总活力的影响
精液分为未洗涤对照、简单离心（15 min, 600 g, 20°C）和单层胶体离心（SLC, 20 min, 400 g, 20°C, EquiPure）组，离心后沉淀重悬于INRA96至20×10^6精子/mL，部分补充5% EYP，4°C保存24小时后评估
MALDI-TOF分子谱分析
表征4°C保存过程中精子肽型和蛋白型谱的动态变化及EYP的影响
精液稀释于含0%、2.5%、5%、10% EYP的INRA96中，4°C保存0、1、3、6、24、48小时，洗涤后用ICM-MS分析，创建公驴和种公马各5头的混合样本，每个样本15个技术重复
体内生育力验证
评估4°C保存24小时的精液（含或不含5% EYP）经深部子宫内授精后的受胎率
母驴在排卵诱导后24小时于优势卵泡同侧子宫角尖端进行深部子宫内授精，每次授精剂量为200 million精子/0.5 mL，授精后14天诊断妊娠
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 精液采集 | Colorado模型人工阴道 | -- | -- |
| 精子分析 | IVOS II 计算机辅助精子分析仪 | Hamilton Thorne Biosciences | -- |
| 20 μm校准玻片 | CellVision Technologies | CV 1020-4cv | |
| 精液稀释 | INRA96稀释液 | IMV Technologies | 016441 |
| BotuSemen Gold稀释液 | Botupharma | BTSGW-100 | |
| Beyond稀释液 | Minitube | 13570/0100 | |
| 精浆去除 | EquiPure单层胶体离心液 | Nidacon | EPB-100 |
| MALDI-TOF质谱分析 | MTP Polished 384 MALDI板 | Bruker Daltonics | -- |
| RapifleX MALDI Tissuetyper TOF质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| 人工授精 | 0.5 mL细管 | IMV Technologies | 005569 |
| 圆头导管 | IMV Technologies | 019839 | |
| 排卵诱导 | Decapeptyl（GnRH类似物） | IPSEN | -- |
| 黄体溶解 | Enzaprost（前列腺素） | CEVA Santé Animale | -- |
| 超声监测 | ExaPad超声设备配7.5 MHz线性探头 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 商业稀释液比较 | 精子浓度20×10^6精子/mL；三种稀释液（INRA96、BotuSemen Gold、Beyond）；4°C保存24小时；公驴n=4次射精，种公马n=6次射精 阅读提示：Methods 'Semen dilution in commercial extenders and storage conditions'；Table 2和Table 3 |
| EYP浓度优化 | EYP浓度0%、2.5%、5%、10%；INRA96基础稀释液；4°C保存48小时；公驴n=12次射精，种公马n=15次射精 阅读提示：Methods 'Preparation of EYP'和'Semen dilution in commercial extenders and storage conditions'；Figure 1 |
| 精浆去除效果评估 | 离心条件：简单离心15 min, 600 g, 20°C；SLC 20 min, 400 g, 20°C；EquiPure；重悬至20×10^6精子/mL；含或不含5% EYP；4°C保存24小时 阅读提示：Methods 'Washing procedures and sperm processing'；Figure 5和Figure 6 |
| MALDI-TOF质谱分析 | EYP浓度0%、2.5%、5%、10%；保存时间0、1、3、6、24、48小时；精子浓度150,000精子/μL；CHCA基质；15个技术重复；公驴和种公马各5头混合样本 阅读提示：Methods 'Intact-cell MALDI-TOF mass spectrometry analysis'；Figure 3和Figure 4；Supplementary Fig. 1 |
| 体内生育力验证 | 授精剂量200 million精子/0.5 mL；深部子宫角尖端授精；每个处理组20次AI在10头母驴中进行；排卵诱导后24小时授精；妊娠诊断在第14天；含或不含5% EYP的4°C保存24小时精液 阅读提示：Methods 'Experiment 3: in vivo fertility trials'；Figure 7；Supplementary Table 1 |