公共测序数据获取与样本筛选
获取非人灵长类全基因组测序数据并筛选符合比较群体多样性研究目标的样本
从SRA下载双端短读长数据，查询WGS或WGA数据集，人工整理元数据，优先保留野生捕获个体或群体多样性面板样本，排除生物医学或临床研究样本；共处理3,240个BioSample，覆盖269个物种、71个属。
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一个精选的非人灵长类基因组尺度核苷酸多样性面板
A curated genome-scale nucleotide diversity panel of non-human primates
实验完整度
低文献为数据资源型研究，主要基于公共测序数据进行变异检出和群体遗传分析，无湿实验功能或机制验证
主要模型
269个物种、71个属的3,240个非人灵长类个体公共短读长测序样本 47个非人灵长类参考基因组组装及人类T2T参考 49个参考组装的多个基因组比对（含Homo sapiens与Tupaia belangeri外群）
重点核对
通过X染色体衍生contig归一化覆盖度进行遗传性别判定，将未知性别样本从1,384降至5 样本平均read覆盖度：全基因组22.31×，常染色体22.57×，X染色体17.53× 核苷酸多样性分析限制在常染色体映射深度≥20×且基因型缺失比例<1%的个体，共1,427个个体、255个物种、71个属 物种特异性callability mask使用测序深度≥10×且通过覆盖比例cutoff的样本定义 gVCF个体基因型过滤标准：DP<5、GQ<30、杂合位点AD<3、低深度/高深度等位基因深度比<0.3
摘要
背景：灵长类是最具系统发育和生态多样性的真兽亚纲哺乳动物目之一，在推进我们对人类进化、物种形成过程和保护生物学的认识方面具有核心作用。尽管在许多灵长类分类群中已有数千个全基因组序列可用，但数据处理中的差异——特别是性连锁区域缺乏考虑倍性的变异检出——限制了现有数据集用于大规模比较分析的价值。结果：在此，我们利用公开可得的非人灵长类短读长测序数据、最近发表的灵长类基因组组装以及一种考虑倍性的变异检出流程，生成了一个基因组尺度的核苷酸多样性面板，涵盖269个物种、71个属的3,240个个体。为了进一步促进跨物种比较，我们生成了用于变异检出的灵长类组装的多个基因组比对。结论：这一精选的非人灵长类多样性资源为未来灵长类进化生物学、物种形成和性染色体进化研究提供了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 现有非人灵长类全基因组数据因数据处理不一致和性连锁区域缺乏考虑倍性的变异检出，难以用于大规模比较分析；本研究旨在构建一个跨物种可比的基因组尺度核苷酸多样性资源。
- 核心机制
- 通过考虑个体遗传性别和区域类型（常染色体、X连锁、Y连锁或线粒体）的倍性感知变异检出，并结合高质量灵长类基因组组装和多个基因组比对，克服既往数据处理限制。
- 主要证据
- 基于3,240个个体、269个物种、71个属的公共短读长数据生成多样性面板；采用Progressive Cactus对49个参考组装进行多基因组比对；对1,427个高质量个体计算常染色体与X染色体杂合度，显示X:A杂合度比多数低于0.75；PCA区分Papio和Macaca物种及种群结构。
- 研究意义
- 该精选非人灵长类多样性资源为未来灵长类进化生物学、物种形成和性染色体进化研究提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
参考基因组准备与读段比对
将短读长数据映射到高质量灵长类参考基因组，为变异检出做准备
获取47个用于映射的非人灵长类参考组装和人类T2T参考；过滤参考contig至≥1000 bp；对大猿和合趾猿的Y连锁拟常染色体区域进行mask；使用bwa index和samtools faidx索引；将FASTQ转为uBAM，标记接头，使用bwa mem比对，并用picard合并、标记重复和排序。
性染色体contig鉴定与遗传性别判定
为性连锁区域变异检出提供正确的倍性信息
基于与人类X染色体的比对鉴定X染色体衍生contig；利用X染色体衍生contig归一化覆盖度对高覆盖样本进行遗传性别判定；进一步基于男女性覆盖度差异鉴定X和Y染色体contig；对低覆盖样本使用X/常染色体覆盖度比或Y/X非零覆盖比例，并用最近邻分类器辅助判定。
倍性感知变异检出与联合基因分型
生成考虑性别和区域倍性的全基因组变异和基因型数据
将个体BAM按2 Mb区间拆分并添加read-group；使用GATK HaplotypeCaller结合-ploidy选项反映遗传性别和区域类型，以-ERC BP_RESOLUTION生成gVCF；使用GenomicsDBImport按物种合并gVCF，并通过GenotypeGVCFs联合基因分型；最后用picard SortVcf拼接为染色体或contig级gVCF。
Callability mask构建与gVCF过滤
保留可靠基因型并定义可用于多样性估计的高置信区域
使用测序深度≥10×且通过物种特异性覆盖比例cutoff的样本构建物种特异性callability mask；保留每个contig覆盖度在对应contig类型平均覆盖度0.5×至2×之间的位置，合并为≥100 bp的bed区域；过滤gVCF保留SNP并拆分多等位变异，排除LowQual及低质量位点，将不满足深度、基因型质量等标准的个体基因型设为缺失。
样本质量控制
识别低质量样本和物种标签或系统发育距离异常样本
计算参考基因组覆盖比例、覆盖部分测序深度、缺失率和序列分歧；设置覆盖比例阈值，大多数属常染色体和X染色体阈值均为0.9；将物种按与参考物种的系统发育距离分组，并进一步拆分具有明显群体结构的物种；基于中位数和IQR计算稳健z分数，识别覆盖比例过低、序列分歧过高或过低的离群样本，分配ok、warn或fail状态。
核苷酸多样性分析
评估灵长类常染色体和X染色体遗传多样性模式及X:A杂合度比
将分析限制在常染色体映射深度≥20×且基因型缺失比例<1%的个体，共1,427个个体、255个物种、71个属；计算按个体和按家族的常染色体与X染色体杂合度，并计算X:A杂合度比；结果显示家族间常染色体杂合度差异大，X:A比多数低于0.75。
PCA分析
在Papio和Macaca大亚样本中评估遗传变异聚类和群体结构
对映射到Papio anubis参考的251个个体和映射到Macaca mulatta参考的183个个体分别进行常染色体和X连锁变异PCA；过滤低覆盖样本、非双等位位点、MAF<10%和LD>0.5的变异；男性X连锁基因型在PCA中按二倍体处理。
多基因组比对
促进跨物种比较和参考基因组与人类序列的比对性分析
使用Progressive Cactus生成包含48个灵长类参考组装和Tupaia belangeri外群的多基因组比对；每个参考仅保留≥1 Mb contig；对未软屏蔽序列使用RepeatMasker和Dfam库处理；将HAL格式转为MAF格式，以人类基因组为参考，计算各基因组覆盖人类基因组的比例及与人类序列的成对分歧。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 数据处理与脚本 | cat命令 | GNU coreutils | -- |
| 数据下载与处理 | wget下载工具 | GNU | -- |
| 短读长数据转换为uBAM | picard FastqToSam | Broad Institute | -- |
| 参考基因组contig过滤 | BBmap reformat脚本 | BBMap | -- |
| Y连锁拟常染色体区域mask | bedtools maskfasta | BEDTools | -- |
| 参考基因组索引 | bwa index | BWA | -- |
| samtools faidx | SAMtools | -- | |
| 序列字典创建 | GATK CreateSequenceDictionary | Broad Institute | -- |
| 读段比对与预处理 | picard SplitSamByNumberOfReads | Broad Institute | -- |
| picard MarkIlluminaAdapters | Broad Institute | -- | |
| picard SamToFastq | Broad Institute | -- | |
| bwa mem读段比对 | BWA | -- | |
| picard MergeBamAlignment | Broad Institute | -- | |
| picard MergeSamFiles | Broad Institute | -- | |
| picard MarkDuplicates | Broad Institute | -- | |
| picard SortSam | Broad Institute | -- | |
| 变异检出 | GATK HaplotypeCaller | Broad Institute | -- |
| gVCF合并与联合基因分型 | GATK GenomicsDBImport | Broad Institute | -- |
| GATK GenotypeGVCFs | Broad Institute | -- | |
| gVCF处理 | picard SortVcf | Broad Institute | -- |
| gVCF过滤与操作 | bcftools | SAMtools | -- |
| gVCF位点索引 | GATK IndexFeatureFile | Broad Institute | -- |
| 多基因组比对 | RepeatMasker | RepeatMasker | -- |
| Dfam重复序列库 | Dfam | -- | |
| Progressive Cactus | Progressive Cactus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 公共数据获取与样本筛选 | 纳入样本标准：全基因组测序或全基因组扩增数据，优先野生捕获个体或群体多样性面板；排除生物医学或临床研究样本；样本数为3,240个BioSample、269个物种、71个属 阅读提示：Methods中Raw data acquisition and preparation for read mapping小节 |
| 遗传性别判定 | 高覆盖样本性别判定阈值：全基因组覆盖度>10×且非零覆盖基因组比例>75%；女性归一化X覆盖度>0.8，男性<0.7；低覆盖样本使用最近邻分类器或X/常染色体覆盖度比 阅读提示：Methods中Calling sex chromosome-derived contigs with correct ploidy小节 |
| 变异检出与联合基因分型 | GATK HaplotypeCaller使用-ploidy选项反映个体遗传性别及区域类型，区间为2 Mb，-ERC BP_RESOLUTION；按物种使用GenomicsDBImport和GenotypeGVCFs联合基因分型 阅读提示：Methods中Variant calling and genotyping小节 |
| gVCF过滤 | 物种特异性callability mask使用测序深度≥10×且通过覆盖比例cutoff样本；位点过滤标准包括QD<2、FS>60、MQ<40、SOQ>3、ReadPosRankSum<-8.0、MQRankSum<-12.5；个体基因型缺失标准包括DP<5、GQ<30、杂合位点AD<3、低/高深度等位基因深度比<0.3 阅读提示：Methods中Callability mask and gVCF filtering小节及Additional file 1: Table S1 |
| 核苷酸多样性分析 | 纳入个体需常染色体映射深度≥20×且基因型缺失比例<1%；共1,427个个体、255个物种、71个属；仅使用≥1 Mb contig 阅读提示：Results中Nucleotide diversity analysis小节和图3 |
| PCA分析 | Papio anubis参考PCA样本数251，Macaca mulatta参考PCA样本数183；覆盖度≥20×；仅双等位位点，MAF>10%，LD>0.5在1000 bp窗口过滤；男性X连锁基因型按二倍体处理 阅读提示：Methods中PCA data filtering小节和图4 |
| 多基因组比对 | 比对包含48个灵长类参考组装和Tupaia belangeri外群；仅保留≥1 Mb contig；使用RepeatMasker v4.1.8和Dfam v3.9；Progressive Cactus v2.9.9；输出以人类基因组为参考的MAF 阅读提示：Methods中Multiple-genome alignment小节及Additional file 1: Table S2 |