小鼠模型建立与角膜内皮表型评估
确定Tcf4 CTG重复扩增是否足以在体内诱导FECD样角膜内皮结构异常。
对20、40、60周龄野生型和Tcf4(CTG)100/(CTG)100小鼠进行接触式镜面显微镜检查，观察胬肉样异常。
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Tcf4 CTG重复扩增在Fuchs内皮性角膜营养不良小鼠模型中诱导RNA毒性和MBNL相关剪接失调
Tcf4 CTG Repeat Expansion Induces RNA Toxicity and MBNL-Associated Splicing Dysregulation in a Mouse Model of Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy
实验完整度
高包含体外样角膜内皮组织FISH、RT-PCR、qPCR、Western blot及RNA-Seq多层级验证，并有人类FECD数据跨物种比较。
主要模型
Tcf4(CTG)100/(CTG)100敲入小鼠角膜内皮组织 野生型小鼠角膜内皮组织 人FECD角膜内皮RNA-Seq数据
重点核对
Tcf4(CTG)100/(CTG)100小鼠在20、40、60周龄的角膜内皮中CUG重复RNA foci阳性核百分比及MBNL1共定位Manders系数 60周龄小鼠角膜内皮Mbnl1和Mbnl2表达水平及Mbnl2外显子6、外显子9、Mbnl1外显子6的自调控剪接 60周龄小鼠角膜内皮RNA-Seq中差异可变剪接事件数及MBNL1基序富集 60周龄小鼠角膜内皮总Tcf4表达及Tcf4-225异构体水平 人FECD角膜内皮中NUMA1外显子16、PPFIBP1外显子19、INF2外显子22、ADD3外显子14的剪接变化
摘要
目的：确定Fuchs内皮性角膜营养不良（FECD）的Tcf4 CTG重复敲入小鼠模型是否在体内重现角膜内皮细胞中重复RNA毒性和MBNL相关剪接失调的分子特征。方法：通过接触式镜面显微镜和CUG重复RNA FISH结合MBNL1免疫染色，检查20、40和60周龄野生型和Tcf4(CTG)100/(CTG)100小鼠的角膜内皮组织。在60周时，使用RT-PCR、定量PCR、Western blotting和RNA-Seq分析评估Mbnl自调控剪接、全基因组可变剪接、RNA结合蛋白基序富集和Tcf4异构体组成；将选定的剪接事件与人类FECD数据进行比较。结果：Tcf4(CTG)100/(CTG)100小鼠在20周时既未显示明显的胬肉样异常，也未显示核RNA foci；两者在40和60周时均被检测到，而野生型小鼠在任何年龄均未显示。foci阳性细胞核和RNA foci–MBNL1共定位在40和60周之间无差异。尽管Mbnl1和Mbnl2转录水平以及MBNL1和MBNL2蛋白水平未改变，但Mbnl2外显子6包含减少。RNA-Seq再分析鉴定出645个差异可变剪接事件，主要为外显子跳跃，在增加外显子跳跃的事件中MBNL1基序富集。代表性MBNL调控事件在小鼠模型和人类FECD之间仅部分保守。总Tcf4表达未改变，而Tcf4-225选择性上调。结论：该模型提供体内证据，表明Tcf4 CTG重复扩增可诱导重复RNA毒性的分子标志和下游MBNL相关剪接失调，以及选择性Tcf4异构体改变。它为机制和治疗研究提供了体内平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Tcf4 CTG重复扩增是否足以在体内诱导角膜内皮细胞中重复RNA毒性和MBNL相关剪接失调的分子特征？
- 核心机制
- Tcf4 CTG重复扩增产生的CUG重复RNA形成核RNA foci并招募MBNL1，导致MBNL相关剪接失调及选择性Tcf4异构体改变。
- 主要证据
- 在Tcf4(CTG)100/(CTG)100小鼠角膜内皮中检测到核RNA foci及MBNL1共定位，Mbnl2外显子6包含减少，RNA-Seq鉴定645个差异可变剪接事件且增加外显子跳跃事件中MBNL1基序富集，Tcf4-225选择性上调。
- 研究意义
- 提供体内证据支持RNA毒性及下游MBNL相关剪接失调是重复扩增的分子后果，并建立该模型作为机制和治疗研究的体内平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
核RNA foci形成及MBNL1共定位检测
验证Tcf4 CTG重复扩增是否在角膜内皮细胞中诱导CUG重复RNA foci并招募MBNL1。
对20、40、60周龄小鼠角膜内皮平铺标本进行CUG重复RNA FISH结合MBNL1免疫染色，共聚焦显微镜成像并定量foci阳性核百分比和Manders共定位系数。
Mbnl自调控剪接及表达分析
评估Tcf4 CTG重复扩增是否改变Mbnl1/Mbnl2自调控剪接及总表达。
对60周龄小鼠角膜内皮进行RT-PCR和RNA-Seq分析Mbnl1外显子6、Mbnl2外显子6和外显子9剪接；Western blot检测MBNL1和MBNL2蛋白水平。
全基因组可变剪接分析及功能预测
确定Tcf4 CTG重复扩增是否导致全基因组可变剪接失调及MBNL1基序富集。
使用rMATS-turbo分析60周龄小鼠角膜内皮RNA-Seq数据中的SE、A3SS、A5SS、MXE、RI事件；NEASE预测蛋白特征影响；rMAPS2分析RBP基序富集。
代表性剪接事件的跨物种比较与RT-PCR验证
比较小鼠模型与人类FECD中MBNL调控剪接事件的保守性并验证RNA-Seq结果。
在人类FECD RNA-Seq数据中分析直系同源事件（NUMA1外显子16、PPFIBP1外显子19、INF2外显子22、ADD3外显子14）；在小鼠中通过RT-PCR验证Numa1外显子15、Ppfibp1外显子18、Inf2外显子22、Add3外显子14及Esrp1外显子14、Map2外显子10、Homer1外显子6、Pgap2外显子2。
Tcf4异构体水平分析
评估Tcf4 CTG重复扩增是否改变Tcf4异构体组成而不影响总表达。
对60周龄小鼠角膜内皮进行qPCR检测总Tcf4表达；RNA-Seq分析Tcf4异构体差异表达及组成；比较小鼠Tcf4-225与人TCF4-272结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物麻醉 | 七氟烷 | Nikko Pharmaceutical | -- |
| 局部麻醉 | 0.4%盐酸奥布卡因滴眼液 | Santen Pharmaceutical | -- |
| 角膜内皮成像 | 接触式镜面显微镜 | Konan Medical | CellCheck C |
| FISH | 5′-FAM标记的靶向CUG重复RNA的2′-O-甲基RNA探针 | Integrated DNA Technologies | -- |
| FISH后免疫染色 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗MBNL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47740 | |
| Alexa Fluor 594标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Dojindo Laboratories | -- | |
| 共聚焦成像 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | TCS SPE |
| RNA提取 | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | ReverTra Ace α | Toyobo | -- |
| RT-PCR | KOD FX Neo | Toyobo | -- |
| qPCR | TaqMan Fast Advanced预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | Mm00443196_m1; Mm99999915_g1 | |
| QuantStudio 3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA缓冲液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | GE Healthcare | -- | |
| 脱脂奶粉 | Nacalai Tesque | -- | |
| 抗MBNL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47740 | |
| 抗MBNL2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-136167 | |
| 抗GAPDH抗体 | MBL | M171-3 | |
| HRP标记羊抗小鼠IgG二抗 | Cytiva | NA931V | |
| Chemi-Lumi One Ultra | Nacalai Tesque | -- | |
| ImageQuant LAS 4000 mini系统 | Fujifilm | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与时间点 | 小鼠基因型：Tcf4(CTG)100/(CTG)100纯合敲入，对照为野生型；分析时间点：20、40、60周龄；每组样本量：n=8眼来自4只小鼠。 阅读提示：Methods 'Animal Studies'；Figure 1A–D图注。 |
| 角膜内皮FISH与MBNL1免疫染色 | CUG探针序列5′-FAM-CA(CAG)₆及终浓度20 ng/µL；MBNL1抗体3A4稀释1:200；foci阳性核计数方法：每样本随机4视野，手动计数DAPI阳性核，无最小foci大小阈值。 阅读提示：Methods 'Fluorescence In Situ Hybridization'；Figure 1B–D图注。 |
| Mbnl自调控剪接RT-PCR | RT-PCR循环条件：94°C 2 min；32循环（98°C 10 s, 66°C 30 s, 68°C 15 s）；68°C 5 min；目标外显子：Mbnl1外显子6、Mbnl2外显子6和外显子9；60周龄小鼠；每组5个生物学重复，每个3个技术重复。 阅读提示：Methods 'RT-PCR and Quantitative PCR Analyses'；Figure 2F–H图注。 |
| RNA-Seq差异剪接分析 | rMATS-turbo v4.3.0；显著性标准：FDR < 0.05且|IncLevelDifference| > 0.2；事件类型：SE、A3SS、A5SS、MXE、RI；每组5个生物学重复。 阅读提示：Methods 'Alternative Splicing Analysis'；Figure 4A–F图注。 |
| Tcf4异构体分析 | qPCR总Tcf4表达使用TaqMan探针Mm00443196_m1，内参Gapdh Mm99999915_g1；异构体差异表达标准：adjusted P < 0.05且|log2 fold change| > 1.0；Tcf4-225 (ENSMUST00000201091)。 阅读提示：Methods 'TCF4/Tcf4 Isoform Expression Analysis'；Figure 5A–F图注。 |