志愿者免疫与样本采集
获取疫苗加强接种后活化的浆母细胞以分离HBsAg特异性mAb
一名既往接种疫苗的志愿者接受一剂酵母来源基因型A重组乙型肝炎疫苗加强针，接种后第7天采集外周血单核细胞（PBMCs）和血浆。
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浆母细胞来源的HBsAg特异性抗体的表征及其与天然HBsAg二聚体结合的结构基础
Characterisation of plasmablast-derived HBsAg-specific antibody and its structural basis for binding to native HBsAg dimer
实验完整度
高体外细胞模型、动物模型和冷冻电镜结构验证，包括功能验证（中和、ADCP）和机制验证（结构解析、定点突变）。
主要模型
从一名既往接种疫苗并接受加强针的志愿者外周血中分选的CD19+CD20−CD3−CD27hiCD38hi浆母细胞 基于AAV-HBV的HBV持续感染C57BL/6小鼠模型 HepG2-NTCP细胞感染基因型D HBV活病毒模型 HEK293T细胞瞬时转染不同基因型HBsAg表达质粒
重点核对
从加强接种后第7天采集的外周血单核细胞中分选浆母细胞，共获得92个HBsAg特异性IgG mAb SY-4和SY-23在AAV-HBV小鼠中单次尾静脉注射400 µg（20 mg/kg），在治疗后第0、1、2天监测血清HBsAg、HBV DNA、HBV pgRNA和HBeAg水平 SY-23与HBsAg二聚体结合的cryo-EM结构分辨率3.9 Å，结合界面涉及HCDR1的R30、S31、Y32和HCDR2的I54、F55 对HBsAg的8个变异体（Q129A、G130A、P151A、P153A、W156Q、K160A、W163A、E164K）和SY-23的10个单突变体及1个双突变体（R30E、S31A、Y32A、V52Q、I54Q、F55Q、R74E、E110K、Y49A、T56A、R30E+Y32A）进行结合活性验证 竞争ELISA使用SY-35、SY-11、SY-22和SY-57作为竞争抗体，与55个测试mAb（10 µg/mL）竞争结合HBsAg
摘要
背景：浆母细胞来源的HBV表面抗原（HBsAg）特异性单克隆抗体（mAb）及其与天然HBsAg结合的结构基础尚不清楚。目的：我们旨在鉴定浆母细胞来源的HBsAg特异性mAb，评估其抗病毒活性，并解析其与天然HBsAg结合的结构。设计：本研究纳入一名既往接种过疫苗的志愿者，该志愿者接种了一剂重组乙型肝炎疫苗加强针并捐献了血液样本。从新鲜外周血单核细胞中分选活化的浆母细胞并表达mAb。对其基因特征、跨基因型结合活性以及体外和体内抗病毒功能进行了全面分析。使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）测定代表性mAb与天然HBsAg结合的结构。结果：在本研究中，我们直接从一名接种疫苗个体的克隆扩增浆母细胞中克隆了一系列HBsAg特异性mAb。大多数mAb显示出与不同基因型HBsAg蛋白的结合交叉反应性以及中和和抗体依赖性细胞吞噬等抗病毒功能。这些人抗HBsAg mAb，尤其是SY-4类和SY-23类，可能成为抗体药物的良好候选者。测定了SY-23与二聚体HBsAg结合的cryo-EM结构，揭示了其结合机制以及HBsAg主要抗原环（AGL）前所未有的结构细节。结论：总体而言，我们的工作揭示了浆母细胞来源mAb的多样基因特征和不同的抗HBV活性，提供了一系列抗体药物候选物，并且长期寻求的AGL原子模型为全面表征HBV感染和免疫应答过程中AGL的动态构象铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 浆母细胞来源的HBsAg特异性单克隆抗体具有哪些基因特征和抗病毒功能，以及它们如何与天然HBsAg二聚体结合？
- 核心机制
- SY-23通过其重链HCDR1（R30、S31、Y32）和HCDR2（I54、F55）与HBsAg的AGL区域（β2的P151和EH1的K160、W163、E164）形成氢键、盐桥和疏水相互作用；AGL中C139介导的分子间二硫键和C107-C138分子内二硫键以及疏水相互作用稳定HBsAg二聚体。
- 主要证据
- 从疫苗加强接种者浆母细胞中分离出92个HBsAg特异性mAb，大多数显示跨基因型结合、中和和ADCP活性；SY-4和SY-23在AAV-HBV小鼠中快速降低血清HBsAg、HBV DNA和HBV pgRNA；SY-23-Fab与HBsAg二聚体复合物的cryo-EM结构（3.9 Å）揭示了AGL构象和抗原-抗体界面；定点突变验证了关键结合残基。
- 研究意义
- 揭示了浆母细胞来源mAb的多样基因特征和抗病毒活性，提供了一系列抗体药物候选物；长期寻求的AGL原子模型为全面表征HBV感染和免疫应答过程中AGL的动态构象铺平了道路，并有助于抗HBV药物靶点的发现。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单浆母细胞分选与mAb克隆
分离HBsAg特异性单克隆抗体
从新鲜PBMCs中通过流式分选CD19+CD20−CD3−CD27hiCD38hi浆母细胞，进行RT-PCR和巢式PCR扩增IgG抗体可变基因，测序后克隆至表达载体，在HEK293T或HEK293F细胞中表达并纯化。
mAb基因特征和克隆扩增分析
分析mAb的种系基因使用和克隆扩增水平
使用IMGT/V-QUEST程序分析重链和轻链可变基因，进行克隆聚类分析。
结合能力和交叉反应性评估
评估mAb与不同基因型HBsAg的结合能力
通过间接ELISA检测mAb（10 µg/mL）与酵母来源基因型A和CHO来源基因型C HBsAg蛋白的结合；通过流式细胞术检测mAb（5 µg/mL）与HEK293T细胞中瞬时转染的基因型A至J HBsAg的结合。
体外中和和ADCP功能验证
评估mAb的体外抗病毒功能
中和实验：mAb系列稀释后与基因型D HBV活病毒预孵育，加入HepG2-NTCP细胞，感染后第7天检测HBeAg分泌抑制率；ADCP实验：mAb（20 µg/mL）与CHO来源HBsAg蛋白混合后加入THP-1细胞，检测吞噬作用。
体内抗病毒效果评估
在HBV持续感染小鼠模型中评估mAb的治疗效果
使用AAV-HBV小鼠模型，单次尾静脉注射SY-4、SY-23或无关对照mAb，监测血清HBsAg、HBV DNA、HBV pgRNA、HBeAg和ALT水平，并进行肝脏H&E染色和肝内HBV pgRNA检测。
冷冻电镜结构解析
解析SY-23-Fab与HBsAg二聚体结合的结构
将SY-23-Fab与酵母来源HBsAg颗粒结合，去垢剂溶解后经尺寸排阻色谱纯化，制备冷冻电镜样品并收集数据，进行三维重建和模型搭建。
关键结合残基验证
验证SY-23与HBsAg结合界面的关键氨基酸残基
构建HBsAg变异体（Q129A、G130A、P151A、P153A、W156Q、K160A、W163A、E164K）和SY-23变异体（重链：R30E、S31A、Y32A、V52Q、I54Q、F55Q、R74E、E110K；轻链：Y49A、T56A；双突变：R30E+Y32A），通过流式细胞术和ELISA检测结合活性。
冷冻电子断层扫描分析
观察SY-23-Fab与完整HBsAg颗粒的结合
对CHO来源HBsAg颗粒单独或与SY-23-Fab结合后进行冷冻电子断层扫描和三维重建，计数颗粒上的刺突和Fab结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 病毒浓缩 | PEG 8000 | -- | -- |
| 流式细胞术 | CD19-PE-Cy7 | BD Biosciences | -- |
| CD20-APC-H7 | BD Biosciences | -- | |
| CD3-APC-H7 | BD Biosciences | -- | |
| CD27-PE | BD Biosciences | -- | |
| CD38-APC | BD Biosciences | -- | |
| LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 647标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LIVE/DEAD可固定紫色死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | HRP标记山羊抗人IgG抗体 | ZSGB-BIO | -- |
| TMB底物 | Sangon Biotech | -- | |
| 竞争ELISA | 辣根过氧化物酶 | Abcam | -- |
| 血清学分析 | 化学发光免疫分析平台 | innoDx | -- |
| ALT测定 | 比色法试剂盒 | NJJC Bio | -- |
| 微孔板读数仪Varioskan LUX | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HBV pgRNA检测 | HBV pgRNA检测试剂盒 | Shengxiang | -- |
| HBV DNA检测 | HBV核酸检测试剂盒 | DaAn Gene | -- |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
| 逆转录 | FastKing一步法gDNA去除cDNA第一链合成预混液 | TIANGEN | -- |
| qPCR | SuperReal预混液（SYBR Green增强型） | TIANGEN | -- |
| H&E染色 | H&E染色试剂盒 | ShenZhen Beiant Medical Technology | -- |
| SAKURA Tissue-Tek Prisma Plus自动切片染色机 | SAKURA | -- | |
| 抗体表达和纯化 | 蛋白A柱 | Senhui Microsphere Technology | -- |
| Fab制备 | L-半胱氨酸盐酸盐 | Sigma-Aldrich | -- |
| EDTA | Invitrogen | -- | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SEC纯化 | Superose 6 Increase 10/300 GL柱 | GE Healthcare | -- |
| 负染EM | Talos 120C显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| cryo-EM样品制备 | Quantifoil多孔碳膜载网（R1.2/1.3，300目，金） | Quantifiol, Jena, Germany | -- |
| Vitrobot | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| cryo-EM数据收集 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| SPR | Biacore 8K系统 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感器芯片 | GE Healthcare | -- | |
| 定点突变 | Mut Express II快速定点突变试剂盒V2 | Vazyme Biotech | -- |
| HBsAg检测 | HBsAg ELISA试剂盒 | Beijing Wantai Biotech | -- |
| HBeAg检测 | 诊断试剂盒 | KHB | -- |
| ADCP | Western和IP细胞裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 冷冻电子断层扫描 | Gatan成像过滤器Quantum LS | Gatan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 志愿者免疫和样本采集 | 疫苗类型（酵母来源基因型A重组乙型肝炎疫苗，含20 µg HBsAg蛋白）、加强接种后第7天采集PBMCs和血浆、抗体滴度变化（3.1 IU/mL至14.6 IU/mL） 阅读提示：Methods 'Study approval and human samples' 和 Results 'Isolation of 92 HBsAg-specific mAbs from plasmablasts' |
| 浆母细胞分选和mAb克隆 | 分选标记（CD19+CD20−CD3−CD27hiCD38hi）、分选细胞数（192个）、成功扩增的可变基因数（136对）、最终获得mAb数（92个） 阅读提示：Methods 'Isolation of monoclonal antibodies from single plasmablasts by FACS' 和 Results 第一段 |
| AAV-HBV小鼠模型建立和抗体治疗 | AAV血清型（8型）、HBV基因组（D型）、注射病毒量（4×10^11 GC/只）、治疗开始时间（病毒给药后4周）、抗体剂量（400 µg，20 mg/kg）、给药途径（尾静脉注射）、样本采集时间点（第0、1、2天） 阅读提示：Methods 'Study approval and animal experiment' 和 Results 'Binding affinity and potential treatment of representative mAbs' |
| 体外中和实验 | 病毒株（HepAD38来源基因型D HBV）、感染复数（200）、感染时间（24小时）、检测时间（第7天）、检测指标（HBeAg分泌抑制率） 阅读提示：Methods 'Neutralisation assay' |
| cryo-EM结构解析 | Fab与HBsAg摩尔比（1:1.5）、去垢剂（1% n-dodecyl-β-D-maltoside）、溶解时间（至少7小时）、SEC缓冲液组分、cryo-EM数据收集参数（像素尺寸0.855 Å，总剂量50 e-/Å2，分辨率3.9 Å） 阅读提示：Methods 'Cryo-EM sample preparation and data collection' 和 Results 'Structural basis of SY-23 binding to HBsAg' |