MYD88突变华氏巨球蛋白血症中新基因亚型的发现与功能鉴定揭示WNK2的致癌性

WNK2 oncogenicity revealed by the discovery and functional characterization of novel gene isoforms in MYD88 mutated Waldenström's Macroglobulinemia

作者信息Maria Luisa Guerrera, Xia Liu, Nickolas Tsakmaklis, Abigail L Peachey, Amanda Kofides, John Hatcher, Andres Ramirez Gamero, Alberto Guijosa, Guang Yang, Hao Sun, Shirong Liu, Christopher J Patterson, Kirsten Meid, Catherine Flynn, Ruben D Carrasco, Andrew R Branagan, Shayna R Sarosiek, Jorge J Castillo, Kenneth C Anderson, Nikhil Munshi, Steven P Treon, Zachary R Hunter

PMID42420257

期刊Blood Cancer J

发布时间2026-07-08

DOI10.1038/s41408-026-01554-3

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实验完整度

高

多组学队列(264例WM)+原代细胞+IHC+细胞系功能验证，含亚型鉴定、信号通路和TF活性验证

主要模型

264例未经治疗的WM患者BM CD19+细胞 WM细胞系BCWM.1、MWCL-1及BCWM.2 原代BM CD19+ WM细胞和CD138+ PC 稳定过表达WNK2/S-NK1或WNK2/S-NK1e的WM细胞系

重点核对

264例未经治疗的WM患者BM CD19+细胞RNA-Seq，按Early、BCL、PCL亚型分组，对照HDPB和HDMB WNK2/S-NK1或WNK2/S-NK1e慢病毒转导BCWM.1和MWCL-1构建稳定细胞系，以空载体为对照在BCWM.1和MWCL-1稳定细胞中检测ERK1/2、p90RSK和NF-κB磷酸化及48种转录因子核活性 BCWM.1WNK2/S-NK1细胞RNA-Seq筛选差异表达基因，并经qRT-PCR验证前12个差异基因 44例MYD88MUT WM、6例HDMB和8例HDPC进行ERRBS甲基化分析，BSP验证CpG 7-9

摘要

WNK2是已知的在包括多形性胶质母细胞瘤和胰腺导管腺癌在内的一组实体瘤中的抑癌基因。除激酶结构域（KD）依赖性地抑制ERK1/2信号外，WNK2的功能在很大程度上仍不清楚。华氏巨球蛋白血症（WM）是一种惰性但无法治愈的B细胞淋巴瘤，其特征是高度复发的MYD88（MYD88MUT）和CXCR4（CXCR4MUT）突变，可触发持续的NF-κB和ERK1/2信号。尽管在健康B细胞中不表达，WNK2却是MYD88MUT WM中排名最靠前的失调基因之一。为了研究WNK2的调控和信号传导，我们对264例未经治疗的WM进行了多组学分析，包括bulk和PacBio Iso-Seq RNA-Seq及甲基化组，并在细胞系和原代WM细胞中进行了功能研究。WNK2的异常表达成为早期WM几乎普遍存在的特征，也是浆细胞样MYD88MUT WM的标志。我们鉴定出新的亚型，它们携带共同的异常剪接事件，或包含或缺失KD，并且与经典全长亚型不同，由肿瘤细胞高表达。在功能上，WNK2/S-NK1——WM中表达量最高的KD缺失亚型——触发了一个促炎级联反应，激活了ERK1/2和NF-κB信号。我们在一组实体瘤中观察到WNK2类似的癌症特异性上调，包括高度侵袭性的胆管癌。我们的发现揭示了WNK2一种由新的癌症特异性亚型驱动的、此前未记录的致癌功能，并为其作为MYD88MUT WM疾病进展的决定因素以及血液和实体肿瘤肿瘤学中的新治疗靶点的进一步研究提供了框架。

WM队列中WNK2表达谱分析

确定WNK2在MYD88MUT WM不同亚型中的表达水平及与疾病阶段的关系

对264例未经治疗的WM患者BM CD19+细胞进行RNA-Seq检测WNK2表达，按Early、BCL、PCL亚型分组，并与HDPB和HDMB对照比较；在46例WM样本中用qRT-PCR验证。

WNK2蛋白表达验证

在蛋白水平验证WNK2在WM中的表达及其与转录水平的一致性

对30例WM和3例健康供者BM活检组织进行WNK2免疫组化染色，比较不同亚型和基因型WM中WNK2蛋白水平。

WNK2 CpG甲基化分析

探究WNK2基因的DNA甲基化模式及其与表达调控和WM亚型的关系

对44例MYD88MUT WM、6例HDMB和8例HDPC进行ERRBS分析，鉴定WNK2基因上的差异甲基化CpG位点，并通过BSP验证CpG 7-9。

WNK2新亚型鉴定与表达分析

通过PacBio Iso-Seq鉴定WNK2新亚型并分析各亚型家族在WM中的表达贡献

对WM样本进行PacBio Iso-Seq和bulk RNA-Seq，结合Gencode参考鉴定11个新亚型，将转录本分为C-K、S-K、S-NK和Other四组，分析各家族表达比例，并通过多重RT-PCR在28例WM中验证外显子27-28跳跃。

跨癌种WNK2亚型表达比较

比较正常组织和不同肿瘤中WNK2亚型表达谱，确定新亚型表达的癌症特异性

利用公共RNA-Seq数据集分析正常脑、正常结肠和配对胆管癌/癌旁肝组织中WNK2总表达和各亚型家族表达，并与WM数据比较。

WNK2/S-NK1功能验证

验证WNK2/S-NK1过表达对WM细胞信号通路和基因表达的影响

将WNK2/S-NK1和人工构建的WNK2/S-NK1e通过慢病毒转导进入BCWM.1和MWCL-1细胞，获得稳定细胞系，检测ERK1/2、p90RSK、NF-κB磷酸化及48种转录因子核活性，并进行RNA-Seq和qRT-PCR验证差异基因。

实验环节	名称	品牌	货号
转录因子活性分析	转录因子活化谱板阵列I	Signosis Inc.	--
qRT-PCR	QuantStudio 6 Flex实时PCR系统	Applied Biosystems	--

实验环节

名称

品牌

货号

转录因子活性分析

转录因子活化谱板阵列I

Signosis Inc.

qRT-PCR

QuantStudio 6 Flex实时PCR系统

Applied Biosystems

环节	核对要点
临床样本分组与WNK2表达检测	WM患者亚型分类（Early、BCL、PCL）标准及CXCR4突变状态；WNK2高表达阈值>5 TpM；对照HDPB和HDMB的CD19+CD27-和CD19+CD27+分选策略阅读提示：Methods中Primary cells and cell lines及Bulk RNA and PacBio Iso-Seq sequencing小节；Fig. 1A-B图注
WNK2/S-NK1稳定细胞系构建	BCWM.1和MWCL-1细胞的慢病毒转导条件；WNK2/S-NK1和WNK2/S-NK1e序列来源及克隆方法；单细胞克隆筛选和空载体对照设计阅读提示：Methods中Lentiviral transduction experiments小节；Fig. 4A图注及Supplemental Methods
WNK2/S-NK1信号通路检测	免疫印迹检测的蛋白靶点（p-ERK1/2、p-p90RSK、p-NF-κB、p-PAK1）；原代WM细胞和细胞系新鲜裂解液制备；转录因子阵列的luminescence阈值（BCWM.1 log2FC 1，MWCL-1 log2FC 0.5）阅读提示：Methods中In vitro signaling and functional studies小节；Fig. 4B-F图注
CpG甲基化分析	ERRBS分析的44例MYD88MUT WM、6例HDMB和8例HDPC样本来源；111个CpG中17个差异甲基化位点的鉴定标准；BSP验证的CpG位点（7-9）和10例WM样本选择阅读提示：Methods中CpG methylation studies小节；Fig. 2B-E图注及Supplemental Table 5
新亚型鉴定与表达分析	PacBio Iso-Seq分析中11个新亚型的鉴定标准；四个亚型家族（C-K、S-K、S-NK、Other）的分类依据；外显子27-28跳跃的多重RT-PCR引物设计及TBP内参阅读提示：Results中Novel WNK2 isoforms小节；Fig. 3A-E图注及Supplemental Table 3

环节

核对要点

临床样本分组与WNK2表达检测

WM患者亚型分类（Early、BCL、PCL）标准及CXCR4突变状态；WNK2高表达阈值>5 TpM；对照HDPB和HDMB的CD19+CD27-和CD19+CD27+分选策略

阅读提示：Methods中Primary cells and cell lines及Bulk RNA and PacBio Iso-Seq sequencing小节；Fig. 1A-B图注

WNK2/S-NK1稳定细胞系构建

BCWM.1和MWCL-1细胞的慢病毒转导条件；WNK2/S-NK1和WNK2/S-NK1e序列来源及克隆方法；单细胞克隆筛选和空载体对照设计

阅读提示：Methods中Lentiviral transduction experiments小节；Fig. 4A图注及Supplemental Methods

WNK2/S-NK1信号通路检测

免疫印迹检测的蛋白靶点（p-ERK1/2、p-p90RSK、p-NF-κB、p-PAK1）；原代WM细胞和细胞系新鲜裂解液制备；转录因子阵列的luminescence阈值（BCWM.1 log2FC 1，MWCL-1 log2FC 0.5）

阅读提示：Methods中In vitro signaling and functional studies小节；Fig. 4B-F图注

CpG甲基化分析

ERRBS分析的44例MYD88MUT WM、6例HDMB和8例HDPC样本来源；111个CpG中17个差异甲基化位点的鉴定标准；BSP验证的CpG位点（7-9）和10例WM样本选择

阅读提示：Methods中CpG methylation studies小节；Fig. 2B-E图注及Supplemental Table 5

新亚型鉴定与表达分析

PacBio Iso-Seq分析中11个新亚型的鉴定标准；四个亚型家族（C-K、S-K、S-NK、Other）的分类依据；外显子27-28跳跃的多重RT-PCR引物设计及TBP内参

阅读提示：Results中Novel WNK2 isoforms小节；Fig. 3A-E图注及Supplemental Table 3

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