心内膜特异性Hand2敲除小鼠模型的建立与表型分析
验证HAND2在冠状动脉发育中的作用
使用Cdh5-CreERT2和Bmx-CreERT2小鼠与他莫昔芬诱导产生Hand2内皮/心内膜特异性敲除，收集E15.5胚胎，通过免疫荧光、H&E染色和整体染色分析冠状动脉和心脏形态。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
心内膜转录因子HAND2协调缺氧与TGF-β信号通路调控冠状动脉形成
Endocardial transcription factor HAND2 orchestrates hypoxic and TGF-β signaling to modulate coronary artery formation
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠模型、转录组学和CUT&Tag机制验证，且有多重功能验证
主要模型
Hand2-EKO小鼠（Cdh5-CreERT2介导的EC特异性Hand2敲除） Hand2-EKOBmx小鼠（Bmx-CreERT2介导的心内膜特异性Hand2敲除） HUVECs（HAND2过表达） Hand2-EKOPdgfb小鼠（Pdgfb介导的SV来源冠状动脉EC特异性Hand2敲除）
重点核对
Hand2-EKO和Hand2-EKOBmx小鼠在E11.5-12.5或E10.5-11.5诱导敲除，E15.5收集胚胎 在E11.5-12.5给予他莫昔芬诱导Cdh5-CreERT2，在E10.5-11.5给予4-羟基他莫昔芬诱导Bmx-CreERT2 通过免疫荧光检测HAND2和ERG共定位验证敲除效率，并通过qPCR检测Hand2 mRNA水平 CUT&Tag使用HAND2抗体（Abcam, ab200040, 1:20）在E14.5分离的EC中进行 TGF-β2重组蛋白处理Hand2-EKO胚胎以评估冠状动脉恢复情况
摘要
心内膜是冠状动脉血管生成和动脉化的主要来源，通过协调细胞命运转变和迁移来实现。然而，同步细胞命运决定和运动的转录调控网络仍不清楚。在此，我们鉴定转录因子HAND2为冠状动脉血管形成的关键候选因子。小鼠心内膜Hand2缺失破坏了动静脉网络并阻碍了冠状动脉发育，同时伴随心室致密化不全表型。此外，Hand2缺失产生了过多运动缺陷的尖端细胞。RNA-seq分析揭示了缺氧代谢激活增强，但TGF-β/p38MAPK依赖性内皮-间质转化下降。相反，遗传抑制核心缺氧调节因子或药物给予TGF-β2部分恢复了Hand2突变体的冠状动脉缺陷。此外，发现HAND2直接结合靶基因启动子，协调细胞迁移和细胞命运转变。这些发现确定HAND2是冠状动脉动脉化心内膜转录调控网络的重要调节因子，并为冠状动脉疾病提供了潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 心内膜转录因子HAND2在冠状动脉血管生成和动脉化中的功能及其转录调控网络是什么？
- 核心机制
- HAND2直接结合靶基因启动子，抑制缺氧/糖酵解通路并激活TGF-β/p38MAPK依赖性内皮-间质转化和细胞外基质重塑，从而协调心内膜细胞迁移和动脉细胞命运决定。
- 主要证据
- 通过Hand2内皮特异性敲除小鼠模型（Hand2-EKO和Hand2-EKOBmx）显示冠状动脉发育缺陷和心室非致密化；RNA-seq和scRNA-seq揭示缺氧和TGF-β通路改变；CUT&Tag证实HAND2直接结合启动子；抑制HIF通路或给予TGF-β2部分挽救缺陷。
- 研究意义
- 确定HAND2是心内膜冠状动脉动脉化转录调控网络的重要调节因子，为冠状动脉疾病提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组学和单细胞分析
探究HAND2缺失后的基因表达变化和细胞命运改变
从E14.5 Hand2-EKO和对照心脏中分离CD31+TdTomato+ ECs，进行bulk RNA-seq和scRNA-seq，分析差异表达基因和通路。
CUT&Tag assay
鉴定HAND2直接结合的靶基因
从E14.5对照和Hand2-EKO胚胎心脏中分离CD31+TdTomato+ ECs，使用HAND2抗体进行CUT&Tag，分析结合峰。
功能挽救实验
验证缺氧和TGF-β通路在HAND2介导的冠状动脉发育中的作用
通过遗传抑制HIF通路（Hif1α/Hif2α杂合敲除）或给予重组TGF-β2蛋白处理Hand2-EKO胚胎，评估冠状动脉和心脏表型的恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织免疫染色 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| OCT包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| EdU掺入实验 | EdU | Invitrogen | A10044 |
| Click-iT EdU试剂盒 | Invitrogen | C10340 or C10337 | |
| EC分离和流式分析 | 抗CD31抗体 | BD Pharmingen | 551262 |
| 抗EMCN抗体 | Thermo Fisher Scientific | 50-5851-82 | |
| RNA提取 | RNAeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| RT-qPCR | HiScript III逆转录预混试剂盒 | Vazyme | R323-01 |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312-02 | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | 4693132001 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物A | Beyotime | P1081 | |
| 台式匀浆器（BULLET BLENDER） | Eppendorf | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina Pro | Vazyme | TD904 |
| HAND2抗体 | Abcam | ab200040 | |
| 二抗 | Vazyme | AB207-01 | |
| 心室外植体培养 | 基础培养基 | Gibco | C11995500BT |
| Matrigel基质胶 | Corning | 354230 | |
| VEGF165 | PeproTech | 100-20-10ug |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内皮特异性Hand2敲除模型 | 他莫昔芬给药时间（E11.5-12.5）和剂量（文中未明确说明）；4-羟基他莫昔芬给药时间（E10.5-11.5）和剂量；胚胎收集时间（E15.5） 阅读提示：Methods中的Mice小节和Supplemental Methods中的给药方案 |
| 细胞分选和RNA-seq | 细胞分选标记（CD31+TdTomato+）；分选细胞数量（约9,000-12,000）；测序平台（Illumina NovaSeq 6000）；scRNA-seq细胞数（11,000） 阅读提示：Methods中的EC isolation, RNA extraction, and qPCR和Bulk and scRNA-seq小节 |
| CUT&Tag实验 | 抗体稀释比例（1:20）；细胞类型（E14.5 ECs）；试剂盒（Vazyme TD904） 阅读提示：Methods中的CUT&Tag assay小节 |
| TGF-β2挽救实验 | TGF-β2给药剂量（剂量依赖，具体文中未明确说明）；给药途径（文中未明确说明）；分析时间点（E15.5） 阅读提示：Results中的HAND2 harnesses TGF-β部分和图6 |
| 心室外植体培养 | Matrigel比例（1:1）；VEGF165浓度（10 ng/mL）；培养时间（第3天和第9天） 阅读提示：Methods中的Ventricular explant culture and image小节 |