构建抗原均一的MSI/MSS类器官与T细胞共培养平台
在相同抗原呈递条件下，比较MSI和MSS结直肠癌被T细胞识别和杀伤的内在差异。
从32例结直肠癌患者手术标本建立PDO（MSI n=6，MSS n=26），筛选HLA-A2表达；从健康供者PBMC分离CD8+ T细胞，逆转录病毒转导1D3-TCR（MART-1特异性）；PDO加载0.02 µmol/L MART-1ELA肽后与T细胞共培养。
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错配修复功能完好的结直肠癌可通过内在抑制性程序逃避免疫监视
Mismatch Repair-Proficient Colorectal Cancer can evade Immune Surveillance Through an Intrinsic Suppressive Program
实验完整度
高含患者来源类器官体外模型和T细胞功能验证，两组学表面蛋白组分析及糖基化抑制机制验证，多层证据交叉验证。
主要模型
患者来源结直肠癌类器官（MSI和MSS） 健康供者PBMC来源的CD8+ T细胞，经1D3-TCR逆转录病毒转导 表达HLA-A2的永生化B细胞作为抗原呈递细胞
重点核对
PDO加载0.02 µmol/L MART-1ELA肽，避免饱和并确保跨样本可比 共培养T细胞与类器官比例在识别实验为1:2，杀伤实验为5:1 条件培养基（CM）收集前用200 ng/mL IFNγ刺激PDO 24小时 糖基化抑制使用2.5 µmol/L Benzyl-α-GalNAc和100 µmol/L Lith-O-Asp预处理，共培养维持0.25 µmol/L和10 µmol/L 识别和杀伤共培养均加入20 µg/mL抗PD-1抗体（nivolumab）
摘要
尽管微卫星不稳定（MSI）结直肠癌（反映错配修复缺陷）通常对免疫检查点抑制剂有反应，但微卫星稳定（MSS）肿瘤在很大程度上仍耐药。这种差异通常归因于新抗原负荷的差异。然而，抗原非依赖性机制是否导致MSS结直肠癌的免疫逃逸尚不清楚。为解决这一问题，我们构建了一个模型，其中MSI和MSS结直肠癌细胞表达相同水平的、可被T细胞受体工程化T细胞识别的特定抗原。尽管抗原呈递相当，但MSS肿瘤表现出T细胞活化受损、细胞毒性降低和对杀伤的抵抗。我们将这种免疫逃逸与MSS肿瘤分泌组联系起来，后者通过损害免疫突触形成，即使在免疫原性MSI细胞中也抑制了免疫反应。通过质谱进行的表面蛋白质组分析确定了损害免疫识别的糖基化依赖性改变。我们的发现表明，MSS结直肠癌通过由分泌组驱动的内在机制逃避免疫攻击，且与抗原性无关。靶向糖基化相关的抑制途径可能恢复T细胞反应性并改善MSS结直肠癌的免疫治疗疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在抗原呈递水平一致的情况下，MSS结直肠癌是否通过抗原非依赖的内在机制逃避T细胞免疫监视？
- 核心机制
- MSS肿瘤分泌组通过诱导肿瘤细胞表面糖基化依赖性重塑，损害T细胞-肿瘤细胞免疫突触形成，从而削弱T细胞活化和杀伤，该过程独立于抗原性。
- 主要证据
- 表达相同MART-1ELA抗原和HLA-A2的MSI与MSS PDO与1D3-TCR T细胞共培养，MSS肿瘤显示IFNγ、TNFα、granzyme-A/B分泌减少60-85%，CD137表达降低，杀伤抵抗；MSS来源CM可抑制MSI肿瘤的T细胞识别和杀伤；膜蛋白质组显示糖基化相关通路改变；糖基化抑制剂恢复T细胞对MSS肿瘤的识别。
- 研究意义
- 揭示了MSS结直肠癌独立于新抗原负荷的主动免疫逃逸机制，提示靶向糖基化相关抑制通路可能恢复T细胞反应性并改善MSS结直肠癌的免疫治疗疗效，同时为将分泌组分析整合入临床决策和患者分层提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估MSS肿瘤对T细胞识别和杀伤的内在抵抗
验证在抗原呈递一致时，MSS肿瘤是否仍表现出T细胞活化受损和杀伤抵抗。
通过流式检测CD137表达、上清检测IFNγ/TNFα/granzyme-A/granzyme-B释放，以及24小时杀伤共培养（Far Red信号和流式计数珠定量活细胞）评估T细胞反应。
分析肿瘤分泌组对T细胞-肿瘤相互作用的调节
探究MSS肿瘤来源可溶性因子是否直接损害T细胞对肿瘤的识别和杀伤。
收集IFNγ刺激后PDO的条件培养基（CM），在CM存在下进行T细胞对MSI肿瘤的识别和杀伤实验，并通过高内涵成像和单细胞声力技术评估T细胞与肿瘤细胞的接触频率和结合强度。
表面蛋白质组分析揭示糖基化依赖性重塑
无偏分析MSS来源CM如何重塑MSI肿瘤细胞表面蛋白，并鉴定关键修饰。
MSI类器官经IFNγ刺激后，在MSI或MSS来源CM中培养24小时，提取膜蛋白进行LC-MS/MS（DIA模式）分析，进行通路富集和糖基化相关基因关联分析。
功能验证糖基化抑制对T细胞识别的影响
验证糖基化修饰对MSS肿瘤限制T细胞反应性的直接作用。
在MSS来源CM存在下，用O-糖基化抑制剂Benzyl-α-GalNAc和糖基转移酶抑制剂Lith-O-Asp共处理MSI类器官，检测T细胞CD137表达；并在无CM条件下，用糖基化抑制剂处理MSS类器官，检测T细胞活化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| Cultrex 低生长因子基底膜提取物2型 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634010 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| HEPES缓冲液 | Euroclone | ECM0180L | |
| 青霉素/链霉素 | Euroclone | ECB3001L | |
| 不含维生素A的B27添加剂 | Gibco | 12587010 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 人重组EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| 前列腺素E2 | Cayman Chemicals | 14010-1 | |
| TrypLE Express解离液 | Gibco | 12605028 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| 二甲基亚砜 | Euroclone | EMR385250 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| STR鉴定 | GenePrint 10系统 | Promega | B9510 |
| IHC | MLH1抗体，克隆G168-15 | Biocare Medical | PM 220 AA |
| MSH2抗体，克隆FE11 | Biocare Medical | PM 219 AA | |
| MSH6抗体，克隆44 | Biocare Medical | PM265 AA | |
| PMS2抗体，克隆A16-4 | Biocare Medical | PM344 AA | |
| 聚合物检测试剂盒（GAM-HRP） | Microtech | -- | |
| DAB显色试剂盒 | Vector Labs | SK-4100 | |
| 流式分析 | 小鼠抗人HLA-A,B,C-PE | BD Biosciences | 555553 |
| 小鼠抗人HLA-A2-APC | BD Biosciences | 561341 | |
| 小鼠抗人HLA-DP/DQ/DR-FITC | BD Biosciences | 550853 | |
| 近红外活力染料 | Invitrogen | L10119 | |
| Zombie Aqua可固定活力试剂盒 | BioLegend | 423101 | |
| T细胞工程 | X-tremeGENE 9转染试剂 | Merck Millipore | 6365779001 |
| CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-495 | |
| 抗CD3/CD28抗体 | eBioscience | 16-0037-85 | |
| 人AB血清 | Euroclone | ECS0219D | |
| 人重组IL2 | R&D Systems | 200-IL | |
| RetroNectin | Takara | T100B | |
| 抗小鼠TCRβ-PE | BD Biosciences | 561081 | |
| 嘌呤霉素 | Vinci-Adipogen | AG-CN2-0078-M100 | |
| AIM-V培养基 | Gibco | 12055091 | |
| T细胞识别实验 | MART-1肽ELAGIGILTV | -- | -- |
| 苄基-α-GalNAc | MedChemExpress | HY-129389 | |
| 石胆酸O-天冬氨酸 | MedChemExpress | HY-112415 | |
| 抗CD28抗体 | eBioscience | 16-0289-81 | |
| 抗人CD3-PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 332771 | |
| 抗人CD8-BV421 | BD Biosciences | 562429 | |
| 抗人CD137-APC | BD Biosciences | 550890 | |
| Golgi-Plug | BD Biosciences | 555029 | |
| Golgi-Stop | BD Biosciences | 554724 | |
| 抗人IFNγ-APC | BD Biosciences | 554702 | |
| Cytofix/Cytoperm试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 19-144 | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 杀伤实验 | CellTrace远红染料 | Invitrogen | C34564 |
| AccuCount空白计数微球 | Spherotech | ACBP-70-10 | |
| 细胞因子检测 | Cytometric Beads Array人IFNγ Flex试剂盒 | BD Biosciences | 558269 |
| LEGENDplex人CD8/NK panel | BioLegend | 741065 | |
| LEGENDplex人促炎趋化因子panel 1 | BioLegend | 741081 | |
| CTL活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力实验 | Promega | G7573 |
| 高内涵成像 | Cytolight红色染料 | Sartorius | 4705 |
| CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒 | Invitrogen | C34554 | |
| 声力实验 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 |
| 伴刀豆球蛋白A | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| 膜蛋白质组 | Mem-PER Plus膜蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89842 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 质谱分析 | Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FAIMS装置 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ReproSil-Pur C18-AQ微球 | Dr. Maisch Gmbh | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官建立与抗原加载 | PDO来源患者数量及MSI/MSS比例（MSI n=6，MSS n=26）、HLA-A2筛选、MART-1ELA肽加载浓度0.02 µmol/L（避免饱和）、IFNγ预处理200 ng/mL 24小时 阅读提示：Methods 'Organoid Culture'、'Tumor Recognition Assays'，Figure 1B，Supplementary Fig. S5和S6 |
| T细胞工程与共培养 | 1D3-TCR转导效率、CD8+ T细胞纯度、共培养T细胞与类器官比例（识别1:2，杀伤5:1）、共培养时间（识别24小时，杀伤24小时）、抗PD-1抗体浓度20 µg/mL 阅读提示：Methods 'T-cell Engineering and Culture'、'Tumor Recognition Assays'、'Tumor Killing Assay'，Supplementary Fig. S4 |
| 条件培养基收集与处理 | CM收集前IFNγ刺激条件（200 ng/mL，24小时）、收集时细胞密度（2.5e5 cells/mL）、收集后离心去碎片、CM使用前是否冻存 阅读提示：Methods 'CM Collection'，Figure 2B |
| 糖基化抑制实验 | 抑制剂浓度（Benzyl-α-GalNAc预处理2.5 µmol/L，共培养0.25 µmol/L；Lith-O-Asp预处理100 µmol/L，共培养10 µmol/L）、预处理时间（2小时，37°C）、是否与MART-1ELA肽共脉冲 阅读提示：Methods 'Tumor Recognition Assays'，Supplementary Fig. S12，Figure 3H |
| 膜蛋白质组分析 | MSI类器官经IFNγ刺激24小时后在CM中培养24小时、膜蛋白提取试剂盒、LC-MS/MS参数（Exploris 480，FAIMS，DIA模式）、生物重复数（N=3） 阅读提示：Methods 'Membrane Proteome after Exposure to CM'、'Global and Membrane Proteomics MS Analysis'、'DIA MS Analysis and Database Search'，Figure 3E |