FFPE胶质母细胞瘤队列构建与分子分层
建立分子特征明确的FFPE胶质母细胞瘤样本队列，并按EGFR扩增状态分层以评估功能蛋白质组信息。
回顾性选取10例IDH野生型胶质母细胞瘤存档FFPE组织，完成组织学审查、DNA甲基化分型和靶向测序，包括5例EGFR扩增和5例非扩增肿瘤。
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常规FFPE中枢神经系统肿瘤组织的功能蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析补充基因组和表观基因组特征
Functional proteomic and phosphoproteomic profiling of routine FFPE CNS tumor tissue complements genomic and epigenomic characterization
实验完整度
高包含FFPE肿瘤组织质谱蛋白质组/磷酸化蛋白质组检测、DNA甲基化分型、靶向测序及激酶活性推断等多层验证。
主要模型
10例IDH野生型胶质母细胞瘤FFPE组织 5例EGFR扩增胶质母细胞瘤 5例EGFR非扩增胶质母细胞瘤
重点核对
EGFR扩增状态分组：5例EGFR扩增和5例EGFR非扩增胶质母细胞瘤 蛋白质组和磷酸化蛋白质组样本处理：每例FFPE组织打孔，SP3消化蛋白输入55 µg 磷酸化蛋白质组检测：MaxQuant处理DDA数据，磷酸化位点定位概率≥75%，中位数中心化并按匹配全局蛋白质组蛋白丰度校正 差异分析标准：蛋白或磷酸化位点绝对log₂倍数变化>0.58且名义P<0.05 激酶活性推断：基于ProtMapper的激酶-底物关系，使用decoupler和VIPER计算，仅纳入至少5个底物的激酶
摘要
基于基因组和DNA甲基化的分析通过实现稳健的分子诊断和亚分类，已经改变了中枢神经系统（CNS）肿瘤的分类。然而，这些方法主要定义肿瘤身份，并不直接捕获细胞内信号网络的功能状态。蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析通过测量蛋白质丰度和位点特异性磷酸化，提供了互补的分子层面。近期方法学进展使福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织的全面分析日益可行，这提出了功能蛋白质组信息如何补充已建立的分子诊断的问题。在这里，我们应用了一种兼容FFPE的工作流程，对十例全面表征的胶质母细胞瘤进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，包括五例EGFR扩增和五例非扩增肿瘤。质谱在所有病例中产生了稳健的蛋白质组和磷酸化蛋白质组覆盖。全局蛋白质组分析揭示了组相关蛋白丰度和通路差异，包括EGFR扩增肿瘤中EGFR丰度增加，同时显示肿瘤间存在大量重叠。蛋白丰度校正后的磷酸化蛋白质组谱同样显示部分组水平分离，并伴有大量肿瘤间重叠。对蛋白丰度校正后的磷酸化蛋白质组数据进行差异分析，基于预定义的探索性统计标准鉴定出443个磷酸化位点。激酶-底物富集进一步揭示了协调的EGFR和SRC家族相关信号，并在个体肿瘤间存在显著变异。这些发现表明，常规FFPE组织在蛋白质丰度和磷酸化信号水平上保留了生物学一致的功能信息，可与基因组和表观基因组数据一起解释。因此，磷酸化蛋白质组学代表了一个正交的功能层面，可能补充CNS肿瘤已建立的分子表征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 常规FFPE中枢神经系统肿瘤组织能否通过蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析提供与基因组和表观基因组诊断互补的生物学一致的功能信息，并捕获EGFR扩增相关的信号后果及超出二元基因组分类的功能异质性。
- 核心机制
- EGFR扩增与EGFR蛋白丰度增加及蛋白丰度校正后EGFR Y1110、Y1197等磷酸化位点富集相关，并伴随EGFR和SRC家族相关激酶信号协调富集，但肿瘤间存在显著功能异质性。
- 主要证据
- 10例分子特征明确的胶质母细胞瘤FFPE组织质谱分析显示全局蛋白质组中位数7647个蛋白、磷酸化蛋白质组中位数5457个定位磷酸化位点；差异分析鉴定出485个蛋白和443个磷酸化位点；激酶-底物富集显示YES1、FYN、SRC、EGFR等活性富集。
- 研究意义
- 磷酸化蛋白质组学可作为正交功能层面，补充测序、拷贝数分析和DNA甲基化分型，将分子身份与通路活性连接，可能促进CNS肿瘤更全面的分子表征，但需在更大队列中验证并标准化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FFPE组织蛋白提取与质谱样本制备
从常规FFPE组织中回收蛋白质和肽段，用于全局蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析。
FFPE组织打孔后使用SDS和BeatBox组织匀浆器进行机械破碎与加热循环，无需二甲苯脱蜡；BCA定量后采用自动化SP3 workflow进行还原、烷基化和胰蛋白酶消化。
磷酸化肽段富集与LC-MS/MS数据采集
获取全局蛋白质组和位点特异性磷酸化蛋白质组数据，评估FFPE组织中的蛋白丰度和磷酸化信号。
使用Fe3⁺-NTA cartridge在Agilent AssayMAP Bravo平台上富集磷酸化肽段；全局蛋白质组采用DIA方法，磷酸化蛋白质组采用DDA方法，在Orbitrap Exploris 480质谱仪上分析。
蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据处理与质控
评估数据质量、过滤低置信度特征并进行归一化，为下游差异分析提供可靠数据。
磷酸化DDA数据用MaxQuant v2.4.2.0处理，全局DIA数据用DIA-NN v2.3.1处理；过滤定位概率低的磷酸化位点，剔除识别数不足样本，并进行log₂转换、中位数中心化和蛋白丰度校正。
EGFR扩增相关蛋白丰度和磷酸化信号差异分析
验证EGFR扩增状态是否在全局蛋白质组和蛋白丰度校正后的磷酸化蛋白质组中产生可恢复的组相关差异。
对全局蛋白质组和蛋白丰度校正后的磷酸化蛋白质组进行PCA、limma差异丰度分析、Hallmark GSEA和激酶活性推断。
单例肿瘤磷酸化蛋白质组报告框架示例
展示如何在不依赖参考队列的情况下，对单个肿瘤的磷酸化蛋白质组信息进行探索性整理和报告。
选择一例代表性EGFR扩增胶质母细胞瘤P02，生成研究用原型报告，整合质控指标、Reactome通路富集和代表性磷酸化位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Maxwell RSC平台 | Promega | -- |
| Maxwell RSC FFPE Plus DNA试剂盒 | Promega | -- | |
| DNA定量 | Qubit dsDNA宽范围检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DNA甲基化分型 | Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片 | Illumina | -- |
| FFPE组织处理 | Eppendorf twin.tec® PCR Plate 96 LoBind® | Eppendorf | 0030129512 |
| Gyuto磁珠2 × 2 | PreOmics | P.0.00154 | |
| FFPE组织匀浆 | BeatBox®组织匀浆器 | PreOmics | -- |
| 蛋白定量 | Pierce™ BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白超声处理 | Bioruptor仪器 | Diagenode | -- |
| SP3消化 | 透明裙边PCR 96 SuperPlate | Kisker Biotech | 017219 |
| Sera-Mag SpeedBead磁性羧基A和B颗粒 | Cytiva | -- | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 磷酸化肽段富集 | Fe3⁺-NTA cartridge | -- | -- |
| Agilent AssayMAP Bravo平台 | Agilent | -- | |
| LC-MS/MS分析 | UltiMate 3000 UHPLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nanoEase M/Z Peptide BEH C18分析柱 | Waters | 186008795 | |
| Acclaim PepMap300 C18捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质控 | HeLa肽标准品 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本队列与分组 | 10例IDH野生型胶质母细胞瘤FFPE组织，5例EGFR扩增和5例EGFR非扩增；样本来源、肿瘤含量和完整分子数据。 阅读提示：Methods中Patient samples小节和Supplementary Table 1。 |
| FFPE组织蛋白提取 | 组织打孔后100 µL 4% SDS孵育；BeatBox处理4个循环，每循环10 min机械破碎加95 °C 20 min加热；800 rpm离心60 s。 阅读提示：Methods中FFPE tissue processing and protein extraction小节。 |
| SP3消化与蛋白输入 | SP3蛋白输入55 µg/样本；TCEP 10 mM、CAA 40 mM；胰蛋白酶1:10比例，37 °C 16 h，500 rpm。 阅读提示：Methods中Automated SP3-based protein digestion小节。 |
| 磷酸化肽段富集与LC-MS/MS | Fe3⁺-NTA cartridge，Phosphopeptide Enrichment v2.1 workflow；磷酸化样本进样15 µL，DDA 90 min；全局蛋白质组进样1 µg，DIA 90 min。 阅读提示：Methods中Automated phosphopeptide enrichment和LC–MS/MS analysis小节。 |
| 数据处理与统计阈值 | 磷酸化位点定位概率≥75%；样本过滤阈值：全局蛋白质组≥5000蛋白、磷酸化蛋白质组≥3500位点；差异分析绝对log₂倍数变化>0.58且名义P<0.05。 阅读提示：Methods中Preprocessing and quality control和Downstream analysis小节。 |