D2022分离、鉴定与基因组特征分析
确认从豆汁中分离的优势菌株D2022的分类地位和基因组特征。
从豆汁中分离L. cremoris D2022，进行全基因组测序、系统发育和ANI分析，比较胆汁酸代谢相关基因，并评估槲皮素降解活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一株来自中国传统发酵食品豆汁的优势益生菌表现出抗流感活性
A Dominant Probiotic from the Traditional Chinese Fermented Food Douzhier Exhibits Anti-Influenza Activity
实验完整度
高含小鼠IAV感染模型、mBMDCs体外模型、转录组、代谢组、流式、ELISpot及Western blot功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠IAV感染模型 小鼠骨髓来源树突状细胞（mBMDCs） IAV PR8株感染MDCK细胞
重点核对
小鼠模型：6周龄雌性C57BL/6J小鼠，每组n=10，四个独立实验 感染剂量：非致死剂量450 PFU或致死剂量900 PFU PR8，滴鼻接种 D2022干预：每日口服200 µL 2 × 10^9 CFU，从day −5至day 7 检测终点：1、3、7 dpi采样，Experiment 4监测生存至14 dpi 对照设置：PBS载体对照，匹配灌胃程序、体积和频率
摘要
背景：豆汁是一种历史超过1000年的中国传统发酵食品，含有复杂的有益微生物群落。本研究从豆汁中分离出Lactococcus lactis subsp. cremoris（命名为L. cremoris D2022），并评估其抗甲型流感病毒（IAV）感染的效力。方法：使用C57BL/6J小鼠建立IAV感染小鼠模型。口服给予L. cremoris D2022后，通过临床结局（体重变化和生存率）、病理参数（结肠长度、肺指数和肺组织病理学）、炎症细胞因子谱、多组学分析（肺转录组学和盲肠代谢组学）以及适应性免疫反应，对治疗组和模型对照组（IAV感染模型对照组接受磷酸盐缓冲液（PBS））进行比较评估。结果：与PBS处理的模型对照组相比，给予L. cremoris D2022显著减轻了IAV诱导的病理损伤，表现为生存率改善（30% vs. 0%，p = 0.006）、体重下降减少、肺指数降低和结肠长度得以保持。D2022治疗加速了病毒清除，并伴随早期干扰素β（IFN-β）产生增强。随后抑制了晚期过度炎症，包括在7 dpi时降低白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。代谢组学分析显示脱氨基酪氨酸（DAT）、短链脂肪酸（SCFAs）和微生物结合胆汁酸（如熊去氧胆酸（UDCA）和异别石胆酸（isoalloLCA））水平升高。此外，IAV特异性适应性免疫反应显著增强。结论：L. cremoris D2022可保护小鼠免受IAV感染，伴随早期IFN-β反应增强、晚期炎症减轻以及肠道微生物代谢物的相关变化。这些代谢物的因果作用仍有待确定。这些发现支持进一步评估D2022作为辅助预防流感的益生菌候选物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 从中国豆汁分离的L. cremoris D2022是否能保护小鼠抵抗甲型流感病毒感染，以及其相关生物学机制是什么。
- 核心机制
- D2022可能通过早期快速增加IFN-β（可能与代谢物DAT有关）抑制病毒复制，并通过晚期SCFAs和微生物结合胆汁酸减轻过度炎症反应；代谢物的因果作用尚未确立。
- 主要证据
- 在IAV感染小鼠中，D2022提高生存率（30% vs. 0%）、降低肺指数和肺病理评分、保持结肠长度、减少3 dpi肺病毒载量；mBMDCs共培养诱导IFN-β；肺转录组显示1 dpi干扰素相关通路上调、7 dpi炎症通路下调；Western blot显示NF-κB p65和IκBα磷酸化降低；代谢组显示DAT、SCFAs和次级胆汁酸升高；流式和ELISpot显示IAV特异性IFN-γ T细胞反应增强。
- 研究意义
- 研究支持进一步评估D2022作为辅助预防流感的益生菌候选物，并提示豆汁可能作为支持人群抗病毒免疫的实用辅助手段，但尚需人体研究验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠IAV感染模型建立与D2022口服干预
评估D2022对IAV感染小鼠的保护效果。
使用6周龄雌性C57BL/6J小鼠，随机分为Control、PR8 + PBS和PR8 + D2022三组，滴鼻感染PR8，每日口服D2022或PBS，监测生存、体重、肺指数、结肠长度和病毒载量。
D2022对IAV感染小鼠的临床和病理保护评估
评估D2022对IAV感染小鼠生存、体重、肺指数、结肠长度和肺组织病理的影响。
监测体重和生存，测量肺指数和结肠长度，采集肺组织进行H&E染色和病理评分。
D2022对病毒载量和炎症细胞因子的影响检测
评估D2022是否影响肺病毒载量以及肺和血清细胞因子谱。
采集肺组织匀浆，提取病毒RNA，使用商业试剂盒和RT-PCR定量病毒载量；使用Luminex 200检测血清和肺组织匀浆中8种细胞因子和趋化因子。
肺转录组和NF-κB通路验证
探究D2022对IAV感染小鼠肺部基因表达和信号通路的影响。
提取肺组织总RNA，进行RNA测序和GSEA分析；使用Western blot检测NF-κB通路相关蛋白。
mBMDCs体外共培养和IFN-β诱导检测
评估D2022对树突状细胞IFN-β表达的直接影响。
从C57BL/6J小鼠股骨和胫骨分离骨髓细胞，培养分化为mBMDCs，纯化后与D2022共培养，ELISA检测IFN-β。
肠道代谢组学分析
探究D2022对IAV感染小鼠盲肠内容物代谢物的影响。
收集盲肠内容物，使用UPLC I-Class Plus系统耦合QTRAP 6500 Plus质谱仪进行靶向代谢组学定量分析。
适应性免疫反应评估
评估D2022对IAV特异性T细胞反应的影响。
分离小鼠脾细胞，使用流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞及IFN-γ、IL-4分泌；使用ELISpot检测流感HA肽特异性IFN-γ分泌细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒培养与定量 | Madin-Darby犬肾细胞 | -- | -- |
| 细菌培养 | 脑心浸液羊血琼脂平板 | -- | -- |
| 肺组织匀浆 | 组织研磨仪 | QIAGEN | -- |
| 病毒RNA提取 | QIAamp病毒RNA提取试剂盒 | QIAGEN | 163014099 |
| 病毒载量定量 | 甲型流感病毒核酸检测试剂盒 | Jiangsu Hechuang Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| ABI 7500快速实时PCR系统 | ABI | -- | |
| 细胞因子检测 | LabEx生物标志物小鼠8重检测试剂盒 | RD | -- |
| Luminex 200系统 | Luminex Corporation | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RNA完整性评估 | Agilent 2100生物分析仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA测序 | BGISEQ-500测序平台 | Shenzhen BGI Genomics Co., Ltd. | -- |
| mBMDCs培养 | RPMI 1640培养基 | Luminex 200, Luminex Corporation | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Hangzhou Kaihua Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 小鼠IL-4 | PeproTech | -- | |
| mBMDCs纯化 | MojoSort™小鼠CD11c纳米磁珠 | BioLegend | -- |
| IFN-β检测 | ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Cytiva | -- | |
| P65抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化P65抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| β-actin抗体 | LabLead | -- | |
| 兔抗小鼠IgG二抗 | -- | -- | |
| Western blot系统 | Solarbio | -- | |
| 代谢组学分析 | UPLC I-Class Plus系统 | Waters | -- |
| QTRAP 6500 Plus质谱仪 | SCIEX | -- | |
| 流式细胞术 | 细胞激活混合物 | Biolegend | -- |
| 抗CD16/CD32抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD3抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD4抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗CD8抗体 | Biolegend | -- | |
| 染色缓冲液 | Biolegend | -- | |
| 固定/透化缓冲液 | Biolegend | -- | |
| 抗IFN-γ抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗IL-4抗体 | Biolegend | -- | |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD | -- | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 抗小鼠IFN-γ抗体 | -- | -- | |
| HA肽段 | ChinaPeptides Co., Ltd. | -- | |
| 生物素化抗小鼠IFN-γ抗体 | -- | -- | |
| 链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶 | -- | -- | |
| iSpot Spectrum酶联免疫斑点分析仪 | AID | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠IAV感染模型建立 | 小鼠品系和年龄：6周龄雌性C57BL/6J；感染剂量：非致死450 PFU或致死900 PFU PR8；接种途径：滴鼻；麻醉：1%戊巴比妥腹腔注射；每组n = 10；四个独立实验 阅读提示：Methods 2.3和Figure 1A |
| D2022口服干预 | 剂量：200 µL 2 × 10^9 CFU；给药方式：每日口服灌胃；给药时间：day −5至day 7；对照：PBS匹配灌胃程序、体积和频率 阅读提示：Methods 2.3和Figure 1A |
| 病毒载量检测 | 采样时间：3 dpi和7 dpi；肺组织匀浆条件：TissueLyser II，12,000 rpm离心10 min；RNA提取试剂盒：QIAamp Viral RNA Mini Kit；定量系统：ABI 7500 Fast Real-Time PCR System 阅读提示：Methods 2.4和Figure 1F–G |
| 细胞因子检测 | 检测时间：3 dpi和7 dpi；样本：血清和肺组织匀浆；8种因子：IL-1β、IL-6、TNF-α、KC、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ；检测平台：Luminex 200 阅读提示：Methods 2.6和Figure 3、Figure 4 |
| mBMDCs共培养和IFN-β检测 | 小鼠年龄：4–6周龄C57BL/6J；培养基：RPMI 1640 + 10%胎牛血清 + 10 ng/mL GM-CSF + 10 ng/mL IL-4；D2022与细胞比例：10:1；共培养时间：24 h；阳性对照：LPS 阅读提示：Methods 2.8、2.9和Figure 7A |
| 代谢组学分析 | 样本：盲肠内容物；检测平台：UPLC I-Class Plus系统 + QTRAP 6500 Plus质谱仪；靶向定量：HM700超过700种小分子代谢物；数据预处理：MetaX；数据库：KEGG和HMDB 阅读提示：Methods 2.11和Figure 8 |
| 适应性免疫反应检测 | 脾细胞数量：1 × 10^6 cells/well；刺激条件：Cell Activation Cocktail 2 µL/mL，37 °C 5% CO2 4 h；表面染色：anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8，20 min 4 °C；胞内染色：anti-IFN-γ和anti-IL-4，20 min；ELISpot刺激：HA peptides 5 µg/mL，37 °C 5% CO2 20 h 阅读提示：Methods 2.12、2.13和Figure 9 |
| Western blot检测NF-κB通路 | 抗体稀释比例：P65 1:1000、p-P65 1:1000、IκBα 1:1000、p-IκBα 1:1000、β-actin 1:1000；孵育条件：4 °C过夜；检测时间：7 dpi 阅读提示：Methods 2.10和Figure 6 |