FGFR2 Fusions in Pancreatobiliary and Ampullary Cancers: High Detection Rate in FFPE Specimens of Intrahepatic Cholangiocarcinoma with Limited RNA Yields Using Amplicon-Based NGS Assay
含75例FFPE临床标本回顾性队列，40例iCCA；含29例融合验证集、参考品LOD与精密度评估及CAP/CBQA外部能力验证。
75例胰胆管和壶腹部恶性肿瘤FFPE标本队列，其中40例iCCA OCA-P验证集29例FFPE样本，含14例NTRK、8例ROS1、6例ALK融合和1例MET exon 14跳跃 SeraSeq Fusion RNA Mix v4参考材料用于LOD和运行精密度 CAP和CBQA外部能力验证样本
iCCA标本RNA浓度范围0.02–104 ng/µL，6例（15%）低于1 ng/µL，10例（25%）在1–2 ng/µL 报告标准：融合支持reads占融合panel总比对reads≥0.25%且融合支持reads≥200；200–2000支持reads需正交确认 OCA-P验证集检测29例预期融合变体，无假阴性和假阳性，报告灵敏度、特异性和阳性预测值均为100% RNA质控指标：≥500,000比对reads，两个引物池对照信号均>100,000 reads，平均读长>60 bp，至少检测到4个表达对照靶标 RNA扩增程序为26个循环，常规应用且未针对低输入标本选择性增加
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估OCA-P检测融合变体的分析性能，包括灵敏度、特异性和精密度。
使用15 ng RNA/样本、OCA-P workflow w2.1和Oncomine Extended filter chain（hg19）进行验证；评估29例预期融合变体（ALK1、NTRKs或ROS1融合）；SeraSeq Fusion RNA Mix参考材料在两个运行中重复检测以评估18种融合变体的精密度；参加CAP和CBQA能力验证。
在真实世界临床FFPE标本中评估OCA-P检测FGFR2融合的可行性和检出率。
回顾性分析2023年3月1日至2024年6月30日提交FGFR2融合检测的75例胰胆管和壶腹部恶性肿瘤FFPE标本，其中40例iCCA；进行核酸提取、定量、OCAv3 DNA检测和OCA-P RNA融合分析；记录RNA浓度、检出融合变体和DNA变异。
评估OCA-P在RNA产量低于2 ng/µL的标本中是否能可靠检测FGFR2融合。
分析iCCA标本RNA产量分布；比较不同RNA浓度组的总比对融合panel reads和质控通过率；记录低于2 ng/µL标本中FGFR2融合检出情况。
评估RNA外显子tiling作为筛选信号检测未代表融合伴侣的能力，并对部分阳性病例进行正交确认。
记录FGFR2外显子tiling不平衡结果；对200–2000支持reads的样本进行正交检测；一例由RNA外显子tiling初始检出后送参考实验室进行杂交捕获检测确认新融合。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核酸提取 | Promega Maxwell RSC系统 | Promega | AS4500 |
| DNA定量 | Qubit 4荧光定量仪 | Thermo Fisher Scientific Inc. | Q33226 |
| RNA定量 | Quantus平台 | Promega | E6150 |
| DNA变异检测 | Oncomine综合检测v3 | Thermo Fisher Scientific Inc. | A35805 |
| RNA融合分析 | Oncomine综合检测Plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | A49671 |
| 文库制备 | Ion Chef自动化文库制备系统 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| 测序 | Ion 540芯片 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| Ion S5XL测序平台 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- | |
| 数据分析 | Ion Reporter软件5.18版 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- |
| LOD和精密度评估 | SeraSeq融合RNA Mix v4 | SeraCare | 0710-0497 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床标本FGFR2融合检测 | 标本类型和分类：40例iCCA（33例活检和7例手术标本）；RNA浓度范围0.02–104 ng/µL；RNA输入标准为15 ng，不足时使用最大可用RNA但需满足DNA输入标准 阅读提示：Methods 2.1 Case Selection和2.2 Nucleic Acid Extraction, Quantification, Targeted NGS Assays and Bioinformatic Analysis；Figure 1和Figure 2 |
| OCA-P检测报告标准 | 融合支持reads占融合panel总比对reads≥0.25%且融合支持reads≥200；200–2000支持reads需正交确认；FGFR2外显子tiling不平衡作为筛查信号需分子病理学家复核和正交测试 阅读提示：Methods 2.2 Bioinformatic Analysis段落 |
| RNA质控指标 | ≥500,000比对reads；两个引物池对照信号均>100,000 reads；平均读长>60 bp；至少检测到4个表达对照靶标；未满足一项或多项的样本重复检测，两次失败后发出失败结果 阅读提示：Methods 2.2 Bioinformatic Analysis段落中RNA-specific quality metrics |
| OCA-P验证 | 15 ng RNA/样本；OCA-P workflow w2.1；Oncomine Extended filter chain against hg19；29例预期融合变体；6个混合RNA验证文库平均浓度130.3 pM（范围94–158 pM）；参考材料在两个运行中重复检测 阅读提示：Results 3.1 Validation of OCA-P and Participation in External Proficiency Testing |
| RNA文库扩增程序 | RNA目标扩增程序为26个循环，常规应用且未针对低输入标本选择性增加；DNA程序为16个循环 阅读提示：Methods 2.2 Nucleic Acid Extraction, Quantification, Targeted NGS Assays and Bioinformatic Analysis |
| 外部能力验证 | CAP solid tumor RNA融合EQA调查中无FGFR2挑战标本，成功检测5例FGFR3融合挑战；2024年CBQA教育性FGFR2方案中正确识别FGFR2::SORBS3和两例FGFR2::BICC1，第四例FGFR2::STAU2检测到FGFR2表达不平衡并提示需额外检测 阅读提示：Results 3.1 Validation of OCA-P and Participation in External Proficiency Testing |
