卵母细胞收集与体外培养
建立可用于成像、聚类和发育结局评估的小鼠卵母细胞实验体系。
收集B6D2F1小鼠卵母细胞，年轻组6–8周龄，年老组66–70周龄；激素诱导排卵后从输卵管收集COCs，透明质酸酶去除卵丘细胞，单个卵母细胞在20 μL MRC#OS微滴中培养并覆盖矿物油。
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小鼠卵母细胞表型在接受白藜芦醇和维生素B12处理后囊胚反应存在差异
Mouse oocyte phenotypes differ in blastocyst response to resveratrol and vitamin B12
实验完整度
中体外小鼠卵母细胞模型，含放射组学特征提取、GMM聚类、多种补充条件干预及囊胚形成终点评估。
主要模型
B6D2F1小鼠卵母细胞（年轻组6–8周龄） B6D2F1小鼠卵母细胞（年老组66–70周龄）
重点核对
卵母细胞分组：Control、白藜芦醇0.1/0.5/1.0 μM、维生素B12 50/200 pM 囊胚形成终点：day 4评估，未发育至囊胚者归类为非囊胚 聚类定义：基于12个基线重复中695个Control卵母细胞的放射组学特征，GMM拟合簇数=3且不重新拟合应用于其余卵母细胞 年龄分组：年轻组于6–8周龄收集卵母细胞，年老组于66–70周龄收集 激素处理：年轻组PMSG 5 IU和hCG 5 IU，年老组PMSG 10 IU和hCG 10 IU，hCG后14 h收集COCs
摘要
这项实验性实验室研究检验了培养条件与囊胚形成之间的关联是否在放射组学定义的卵母细胞聚类和年龄组之间存在差异。小鼠卵母细胞（n = 2,061）被分配到对照组或五个补充组：白藜芦醇（0.1、0.5、1.0 μM）和维生素B12（50、200 pM）。主要结局是跨形态学聚类和年龄亚组的囊胚形成。鉴定出三个具有不同基线囊胚形成率的聚类：聚类1，28.2%（44/156）；聚类2，42.4%（156/368）；聚类3，34.9%（105/301）。聚类2包含最大且最球形的卵母细胞，具有异质性胞质纹理。聚类3代表最小、最亮且强度分布最均匀的表型，而聚类1显示中等大小、不规则轮廓和高内部对比度。培养条件与囊胚形成之间的关联在放射组学定义的聚类之间存在差异。在聚类1中，囊胚形成率从28.2%增加至45.1%（白藜芦醇1.0 μM）和48.7%（维生素B12 200 pM）。在聚类3中，囊胚形成率从34.9%增加至60.4%（维生素B12 50 pM）和50.0%（白藜芦醇0.1 μM）。聚类2显示从42.4%至57.9%的非显著增加（白藜芦醇0.5 μM）。较老卵母细胞比年轻卵母细胞表现出较低的发育能力。为每个聚类-年龄组合选择表现最佳的培养基使总体囊胚形成率从36.97%（305/825）增加至56.00%（126/225）。这些发现表明放射组学定义的聚类、培养条件与囊胚形成之间存在关联。需要前瞻性聚类分层研究来确定聚类指导的培养条件选择是否能改善发育结局。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 放射组学定义的卵母细胞表型是否对靶向培养基补充表现出不同的发育反应，从而为表型指导的胚胎培养提供功能基础？
- 核心机制
- 卵母细胞表型与母体年龄共同决定对培养基补充的反应性；文中指出下调和中间表型卵母细胞可能因基线表型欠佳而保留更大功能可塑性，而高表现表型已接近发育上限，但放射组学定义表型背后的生物学机制未被直接评估。
- 主要证据
- 对2,061个小鼠卵母细胞进行放射组学特征提取和GMM聚类，鉴定出三个聚类，并在Control条件下比较囊胚形成率；进一步在五个补充条件中比较各聚类及年龄亚组的囊胚形成率，并进行了聚类-年龄组合最佳培养基的事后分析。
- 研究意义
- 研究结果为前瞻性研究提供了基础，以评估聚类指导的补充是否能改善囊胚形成；并支持从经验性、一刀切培养基应用转向合理的、分层的、数据驱动的培养策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
卵母细胞成像与放射组学特征提取
获取标准化的卵母细胞形态学图像，并提取形状和强度相关定量特征。
使用Nikon倒置显微镜和Nikon DS-Fi3彩色数码相机获取裸卵明场图像；训练有素的胚胎学家手动标注胞质ROI，使用PyRadiomics进行掩膜校正和特征提取；提取8个二维形态特征和16个一阶强度特征。
GMM聚类定义卵母细胞表型
基于放射组学特征定义独立于培养条件影响的卵母细胞表型聚类。
使用前12个基线重复中695个Control卵母细胞的放射组学特征建立聚类框架，采用GMM进行无监督聚类，根据AIC和BIC确定最佳聚类数为3；拟合后的特征缩放器和GMM不重新拟合应用于剩余7个重复的1,366个卵母细胞。
培养条件补充与囊胚形成评估
评估不同培养条件在各放射组学聚类和年龄亚组中对囊胚形成的影响。
卵母细胞分配到Control或五个补充条件，补充白藜芦醇或维生素B12；受精后第5 h识别推定受精卵并转移至新鲜10 μL MRC#OS微滴中；胚胎培养至day 4评估囊胚形成。
年龄与培养条件联合分析及最佳培养基事后分析
评估年龄与培养条件对各聚类的联合影响，并比较各聚类-年龄亚组最佳补充与对照的囊胚形成率。
在每个年龄组和聚类内比较五种实验培养基与对照的囊胚形成率；事后分析比较每个聚类-年龄亚组中囊胚形成率最高的培养条件与对照，并汇总所有组合的总体囊胚形成率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 卵母细胞收集与培养 | 孕马血清促性腺激素 | Prospec | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MRC#OS培养基 | Maria Medical Foundation | -- | |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 卵母细胞成像 | Nikon倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Nikon DS-Fi3彩色数码相机 | Nikon | -- | |
| 药物处理 | 白藜芦醇 | Sigma-Aldrich | R5010 |
| 维生素B12 | Sigma-Aldrich | V6629 | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卵母细胞收集与年龄分组 | 年轻组6–8周龄、年老组66–70周龄；年轻组PMSG 5 IU和hCG 5 IU，年老组PMSG 10 IU和hCG 10 IU；hCG后14 h收集COCs；hyaluronidase 300 IU/mL处理3–5 min 阅读提示：Methods中Oocyte preparation and embryo culture小节 |
| 卵母细胞成像与放射组学特征提取 | 200×放大倍数、2880 × 2048 pixels、曝光时间30 ms、模拟增益2.2×、每个卵母细胞单个明场图像且未进行Z-stack；PyRadiomics v3.1.0、Python v3.8.0；提取8个形状2D特征和16个一阶强度特征；像素间距1 × 1重采样；correctMask = True 阅读提示：Methods中Oocyte imaging、Image processing and region of interest (ROI) segmentation、Radiomic feature extraction and normalisation小节及Supplementary Table 1 |
| GMM聚类与聚类应用 | 19个实验重复，前12个基线重复中695个Control卵母细胞用于拟合特征缩放器和GMM，最优聚类数为3；剩余7个重复的1,366个卵母细胞不重新拟合应用；silhouette coefficient 0.351 阅读提示：Methods中Clustering analysis小节及Fig. 2 |
| 培养条件与囊胚形成评估 | Control、白藜芦醇0.1/0.5/1.0 μM、维生素B12 50/200 pM；受精后5 h转移至新鲜10 μL MRC#OS微滴；37°C、湿润、6.0% CO2；day 4判定囊胚；未发育至囊胚者归类为非囊胚 阅读提示：Methods中Culture conditions and outcome assessment、Oocyte preparation and embryo culture小节及Fig. 1 |
| 年龄与培养条件联合分析及最佳培养基事后分析 | 六个聚类-年龄亚组；各亚组最佳补充条件见Supplementary Table 7；总体对照305/825即36.97%，最佳补充126/225即56.00%，P < 0.001，卡方检验；统计使用scipy.stats v1.10.1，显著性为双侧P < 0.05 阅读提示：Results中Combined effect of culture medium and age、Effect of optimal culture medium across cluster age combinations小节及Table 2、Table 3、Supplementary Table 7 |