人泛癌scRNA-seq图谱分析APC丰度与FcγR表达
评估cDC1s、cDC2s和经典单核细胞在肿瘤中的相对丰度及FcγR表达差异
整合36个scRNA-seq数据集，涵盖498,023个细胞、589个样本和12种原发肿瘤类型，分析cDC1s、cDC2s和经典单核细胞的频率及FCGR基因表达
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
将死细胞识别与Fcγ受体偶联可增强抗癌免疫
Coupling dead cell recognition to Fcγ receptors augments anticancer immunity
实验完整度
高包含人scRNA-seq队列分析、小鼠肿瘤模型、体外细胞系、CRISPR敲除和体内功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
人泛癌髓系细胞scRNA-seq队列 小鼠MCA205、MC38、BRAFV600E肿瘤模型 Hoxb8 cDC2细胞系和MutuDC1940 cDC1细胞系 小鼠FLT3L诱导的原代cDC及人CD14+单核细胞衍生APC
重点核对
Fc–DNGR-1与坏死肿瘤细胞的结合及其对F-肌动蛋白的依赖性（WT vs 2WA） Fc–DNGR-1通过FcγRI增强cDC1和cDC2对坏死细胞的吞噬和交叉提呈（CRISPR敲除验证） Fc–DNGR-1在MCA205、CT26、MC38肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果及与多柔比星或放疗的协同 Fc–DNGR-1疗效对CD8+ T细胞的依赖性（anti-CD8α抗体耗竭验证） AFA hIgG1促进人单核细胞衍生APC吞噬坏死细胞及激活（FcγRIIA阻断和SYK抑制剂验证）
摘要
1型常规树突状细胞（cDC1s）是针对癌症的CD8+ T细胞交叉致敏的关键抗原提呈细胞（APCs）。它们可以通过DNGR-1（CLEC9A）捕获并交叉提呈死细胞抗原，DNGR-1是识别暴露于细胞尸体上的F-肌动蛋白的受体。然而，cDC1s在人类和小鼠肿瘤中稀少，这限制了抗癌免疫。我们发现，丰富的肿瘤相关APCs，包括cDC2s和单核细胞衍生细胞，可以通过多种将F-肌动蛋白桥接至Fcγ受体（FcγRs）的试剂，包括Fc–DNGR-1融合蛋白和抗F-肌动蛋白抗体，被重定向以内化坏死碎片并交叉提呈相关抗原。在体内，Fc–DNGR-1积累在坏死肿瘤区域，并突显其与瘤内FcγR+ APCs的邻近关系。在小鼠癌症模型中，F-肌动蛋白–FcγR桥接增强了肿瘤控制，并与细胞毒性化疗或放疗协同作用。因此，非特化APCs可被利用来交叉提呈坏死肿瘤抗原，而F-肌动蛋白–FcγR桥接构成了一种增强抗癌免疫的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过将死细胞识别与FcγR信号偶联，使肿瘤中丰富的非cDC1抗原提呈细胞获得交叉提呈坏死肿瘤抗原的能力，从而增强抗癌免疫？
- 核心机制
- F-肌动蛋白–FcγR桥接试剂（如Fc–DNGR-1或抗F-肌动蛋白抗体）将坏死细胞来源的F-肌动蛋白与APC表面的FcγR连接，通过SYK和NADPH氧化酶信号引发吞噬体膜损伤，使抗原进入胞质MHC-I交叉提呈通路。
- 主要证据
- 在人scRNA-seq泛癌图谱和小鼠肿瘤模型中证实cDC2s和MCs数量远超cDC1s且高表达FcγRs；体外实验证明Fc–DNGR-1通过FcγRI增强cDC1s和非cDC1s对坏死细胞的吞噬和交叉提呈；体内实验证明Fc–DNGR-1以FcγR和CD8+ T细胞依赖的方式抑制MCA205、CT26和MC38肿瘤生长并与化疗或放疗协同。
- 研究意义
- 提出了一种不依赖于特定肿瘤抗原、靶向细胞死亡过程的策略，可利用肿瘤内丰富的非cDC1 APCs增强交叉提呈，为抗癌免疫治疗提供了新思路，并提示抗F-肌动蛋白抗体可能具有临床适用性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠肿瘤模型中APC亚群动态及FcγR功能分析
验证小鼠肿瘤中cDC1s的稀少性以及cDC2s和MCs的FcγR表达和功能
在MCA205、MC38和BRAFV600E肿瘤模型中，于第5天和第12天通过流式细胞术分析APC亚群频率和FcγR表达，并检测OVA-IC的摄取和交叉提呈
Fc–CLR融合蛋白设计与体外功能验证
验证Fc–CLRs能否将坏死细胞识别与FcγR信号桥接，并诱导非cDC1s的坏死细胞吞噬和交叉提呈
设计六种Fc–CLR融合蛋白，筛选出Fc–DNGR-1和Fc–LOX-1，在Hoxb8 cDC2s中检测坏死细胞摄取和OT-I T细胞IFNγ释放，并验证Fc–DNGR-1突变体（2WA和N297A）的功能
Fc–DNGR-1通过FcγRI增强原代cDCs的坏死细胞吞噬和交叉提呈
确定Fc–DNGR-1对原代cDC1s和cDC2s的影响及FcγRI的关键作用
使用FLT3L诱导的原代cDCs，通过CRISPR–Cas9敲除Fcgr1或Fcgr4，检测坏死细胞摄取和OT-I T细胞IFNγ释放
FcγR信号触发吞噬体损伤机制研究
验证FcγR信号是否通过SYK和NADPH氧化酶导致吞噬体膜损伤，从而允许P2C
在RAW264.7细胞中使用IgG-OVA或对照OVA珠子，检测galectin-3募集和胞质eGFP进入吞噬体，并测试SYK抑制剂R406和NADPH氧化酶抑制剂DPI的影响
FcγR+ APC在肿瘤中与坏死区域的定位分析
评估cDC1s、cDC2s和MCs在肿瘤中相对于坏死区域的定位
使用Fc–DNGR-1作为坏死区域标记，在MCA205-LA-OVA-mCherry肿瘤中通过共聚焦显微镜分析MHC-II+ CD103+ cDC1s和CD103−非cDC1s的定位，并使用Clec9aCreRosaLSLtdTomato和Xcr1Venus小鼠进行验证
Fc–DNGR-1体内抗肿瘤效果及与化疗/放疗的协同
验证Fc–DNGR-1能否增强体内抗肿瘤免疫并与细胞毒性治疗协同
在MCA205、CT26和MC38肿瘤模型中，使用WT或2WA Fc–DNGR-1联合多柔比星、奥沙利铂或X射线放疗，监测肿瘤生长和总生存期，并通过Batf3−/−小鼠和anti-CD8α抗体验证机制
抗F-肌动蛋白抗体AFA的生成及其对人APC的功能验证
开发具有临床适用性的抗F-肌动蛋白抗体，并验证其促进人APC坏死细胞吞噬和激活的能力
通过噬菌体展示筛选抗F-肌动蛋白Fab，选择AFA克隆并表达为小鼠IgG2a和人IgG1变体，检测其与坏死细胞的结合、促进人MCGM-CSF/IL-4和MCM-CSF吞噬坏死细胞以及上调HLA-DR、CD86和细胞因子的能力
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 重组小鼠FLT3L | R&D systems | -- | |
| 干扰素α | R&D Systems | -- | |
| 白细胞介素-2 | Peprotech | -- | |
| 重组人GM-CSF | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-4 | Peprotech | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-3 | Peprotech | -- | |
| 白细胞介素-6 | Peprotech | -- | |
| 干细胞因子 | Peprotech | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Worthington | -- |
| DNase I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式分析 | LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 123count eBeads计数微球 | Fisher Scientific | -- | |
| 抗小鼠XCR1 IgG（克隆ZET） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CLEC10A IgG（克隆LOM-14） | BioLegend | -- | |
| 抗人CD14 IgG（克隆HCD14） | BioLegend | -- | |
| 细胞分选 | 抗生物素微珠 | Miltenyi | -- |
| LS柱 | Miltenyi | -- | |
| 抗PE微珠 | Miltenyi | -- | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Fc融合蛋白表达与纯化 | Expi293F细胞 | -- | -- |
| 蛋白A珠 | Generon | M1300-5 | |
| Pierce温和抗原/抗体结合与洗脱缓冲液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 21030 | |
| BupH Tris缓冲盐水包 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce显色内毒素定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SDS-PAGE | mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad | -- |
| Precision Plus双色标准品 | Bio-Rad | -- | |
| 考马斯亮蓝R-250染色液 | Bio-Rad | -- | |
| OVA-IC制备 | 卵清蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 兔抗鸡卵清蛋白全抗血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| FcγR交联 | Nunc MaxiSorp板 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 小鼠IgG1/IgG2a | BioLegend | -- | |
| 小鼠TNF和CXCL2 DuoSet试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| FM珠制备 | G-肌动蛋白 | Cytoskeleton | -- |
| 生物素化G-肌动蛋白 | Cytoskeleton | -- | |
| 肌球蛋白II | Cytoskeleton | -- | |
| 链霉亲和素包被的2微米微珠 | Polysciences | -- | |
| IgG-OVA珠制备 | 3微米羧基化二氧化硅珠 | Kisker | -- |
| 多克隆兔抗OVA IgG | Sigma-Aldrich | SAB4301164 | |
| 吞噬试验 | Cell Tracker-Deep Red染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Annexin V AF647偶联物 | Invitrogen | -- | |
| 交叉提呈试验 | 大鼠抗小鼠IFNγ IgG（克隆R4-6A2） | BD Biosciences | -- |
| 生物素化大鼠抗小鼠IFNγ IgG（克隆XMG1.2） | BD Biosciences | -- | |
| ExtrAvidin-碱性磷酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抑制剂处理 | 乳胞素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 亮抑酶肽 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二亚苯基碘鎓 | Sigma-Aldrich | D2926 | |
| R406 | Selleckchem | S2194 | |
| CRISPR–Cas9基因编辑 | 重组Cas9核酸酶V3 | IDT | -- |
| IDT Alt-R Cas9电穿孔增强剂 | IDT | -- | |
| 4D核转染仪 | Lonza | -- | |
| APC显微镜 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 罗丹明偶联小麦胚芽凝集素 | Fisher Scientific | -- | |
| Prolong Diamond抗荧光淬灭封片剂 | Fisher Scientific | -- | |
| 抗小鼠galectin-3-AF647（克隆M3/38） | BioLegend | -- | |
| 肿瘤显微镜 | Corning Matrigel基底膜基质 | VWR | -- |
| Corning细胞回收溶液 | Fisher Scientific | -- | |
| AF555鬼笔环肽 | Fisher Scientific | -- | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SuperFrost Plus玻璃载玻片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| O.C.T.包埋剂 | Tissue-Tek | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人泛癌scRNA-seq分析 | 数据集来源和整合方法；细胞类型注释标准；样本量和肿瘤类型 阅读提示：Methods中“Myeloid APC transcriptomic analyses”小节和Supplementary Table 3 |
| 小鼠肿瘤模型建立和APC分析 | 肿瘤细胞系（MCA205、MC38、BRAFV600E）；注射细胞量（0.5×10^6）；分析时间点（第5天和第12天）；小鼠品系和性别 阅读提示：Methods中“Mice”和“Murine tissue analysis and flow cytometry”小节，以及Figure 1图注 |
| Fc–DNGR-1融合蛋白的体内抗肿瘤实验 | 给药剂量（50-200μg）；给药途径（i.t.或s.c.）；给药时间（第7天和第11天）；联合治疗（多柔比星2.5 mg/kg、奥沙利铂1.25 mg/kg或10 Gy X射线）；对照组（2WA或LALA-PG Fc–DNGR-1） 阅读提示：Methods中“In vivo tumor experiments”小节和Figure 6图注 |
| Fc–DNGR-1增强坏死细胞吞噬和交叉提呈的体外实验 | APC类型和数量（5×10^4 per well）；坏死细胞制备（UV照射240 mJ/cm²）；Fc–DNGR-1浓度（10 nM）；共培养时间（4小时）；OT-I T细胞比例（2:1） 阅读提示：Methods中“XP assay”和“Flow cytometric phagocytosis assay”小节，以及Figure 2和Figure 3图注 |
| AFA hIgG1促进人APC吞噬和激活实验 | 人APC类型（MCGM-CSF/IL-4和MCM-CSF）；AFA浓度（20 nM）；坏死细胞比例（4:1）；FcγRIIA阻断抗体和SYK抑制剂的使用浓度 阅读提示：Methods中“Preparation of human MCs”和Figure 7图注 |