IJP的合成与表征
制备具有荧光和金半球的Janus颗粒，用于后续sEV检测
在玻璃载玻片上铺展荧光聚苯乙烯微球，沉积约10 nm金层，超声释放颗粒，过滤并浓缩，通过SEM和EDX确认Janus结构
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
使用Janus颗粒快速灵敏检测癌症来源的小细胞外囊泡
Rapid and sensitive detection of cancer-derived small extracellular vesicles using Janus particles
实验完整度
高含体外细胞培养基、人血浆/血清/尿液样本及87例患者队列，并有尺寸排阻、抗体封闭和正交SPR验证
主要模型
DiFi人结直肠癌细胞3D培养 GBM9胶质母细胞瘤细胞 人血浆/血清/尿液样本 87例患者临床队列
重点核对
IJP浓度1×10^7个/ml，样本与IJP按2:1比例混合，孵育1小时 抗体功能化使用Abcam Gold Conjugation Kit，抗体浓度0.1 mg/ml sEV浓度检测限4×10^5 sEV/ml，定量下限1×10^6 sEV/ml，动态范围>3 log10 盲法队列87例，通过aEGFR+/CEA+/GPC1+/pTau181+ sEV标志物分层检测 正交验证方法为超速离心联合表面等离子体共振
摘要
检测小细胞外囊泡对于理解疾病生物学和开发诊断工具至关重要，但现有方法需要冗长的分离步骤，并因大量蛋白质的干扰而缺乏灵敏度。在此，我们报告了一种使用Janus颗粒的检测方法，通过利用布朗旋转诱导的闪烁变化实现快速、免分离的检测。当囊泡结合时，其尺寸会显著改变闪烁频率，而较小的蛋白质不产生信号，从而确保选择性。该方法使用少于10微升的样本，可检测约200个囊泡每微升，并可直接在血浆、血清、尿液和细胞培养基中工作，耗时不到1小时。在一项包含87名结直肠癌、胰腺导管腺癌、胶质母细胞瘤、阿尔茨海默病和健康对照受试者的盲法研究中，该方法以0.90–0.99的曲线下面积识别疾病类型。与需要24小时的超速离心联合表面等离子体共振相比，我们的方法提供了2个数量级更好的灵敏度和动态范围，为临床和研究应用提供了一个快速稳健的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种免分离、快速、灵敏的方法，直接从生物体液中检测小细胞外囊泡的表面标志物，以用于疾病筛查和诊断？
- 核心机制
- Janus颗粒的布朗旋转导致荧光闪烁，结合大于50 nm的sEV后增加旋转阻力，降低闪烁频率，而小于50 nm的蛋白质不产生信号，从而实现尺寸选择性检测。
- 主要证据
- 使用抗CD63等抗体功能化的IJP检测sEV，显示闪烁周期移，检测限4×10^5 sEV/ml，并在87例盲法队列中通过aEGFR+/CEA+/GPC1+/pTau181+ sEV标志物区分CRC、PDAC、GBM、AD和健康对照，AUC为0.90–0.99。
- 研究意义
- IJP平台提供了一种无需分离、快速、灵敏的sEV表面标志物检测方法，适用于临床和研究应用，可用于疾病筛查和治疗监测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IJP抗体功能化
在金半球上固定靶标特异性抗体，使IJP能捕获sEV
使用Abcam Gold Conjugation Kit将抗体偶联到IJP金半球，离心洗涤后重悬于PBS
IJP与样本孵育及闪烁检测
通过IJP闪烁频率变化检测样本中sEV
将功能化IJP与样本按2:1比例混合，孵育1小时，取2 μl在荧光显微镜下拍摄视频，分析闪烁频率
sEV浓度校准与验证
建立IJP闪烁信号与sEV浓度的定量关系，评估检测限和精密度
使用已知浓度的sEV绘制校准曲线，测定LoB、LLOD、LLOQ、精密度和回收率
尺寸选择性与干扰验证
验证IJP仅对大于50 nm的颗粒产生信号，排除可溶性蛋白和脂蛋白干扰
使用220 nm、100 nm和50 nm滤膜过滤血浆，比较信号；使用isotype对照和裂解sEV验证特异性；使用模拟血浆调整sEV/非sEV比例
临床样本盲法检测
评估IJP平台在混合疾病队列中区分疾病类型的能力
使用aEGFR、CEA、GPC1和pTau181抗体功能化IJP，检测87例受试者血浆sEV，进行分层诊断分析
正交验证：超速离心联合SPR
用传统方法验证IJP检测结果的可靠性
对相同样本进行超速离心分离sEV，然后用SPR检测表面标志物，与IJP结果比较
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IJP制备 | FluoSpheres聚苯乙烯微球 | Thermo Fisher Scientific | F13081/F13083 |
| 异丙醇 | VWR | BDH7999-4 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 48300-026 | |
| 高频发生器 | Electro-Technic Products | Model BD-20 | |
| 电子束真空沉积/薄膜镀膜系统 | AIRCO Temescal | FC 1800 | |
| 超声波清洗器 | Bransonic | 5510R-DTH | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 5 μm圆盘过滤器 | Cytiva Whatman Puradisc | 10463533 | |
| 抗体功能化 | 金偶联试剂盒 | Abcam | ab154873 |
| 10 K截留分子量离心过滤器 | Thermo Fisher Scientific | 88513 | |
| PCR管 | Axygen | PCR-02-C | |
| Fisher Accu-Spin Micro 17离心机 | Fisher | -- | |
| 荧光成像 | Olympus IX-71倒置荧光显微镜 | Olympus | -- |
| Olympus Optical 100 W高压汞灯 | Olympus | BH2-RFL-T3 | |
| Retiga EXi相机 | QImaging | 01-RET-EXI-L-M-14-C | |
| Basler ace 2 R相机 | Basler | a2A1920-160ucPRO | |
| 免疫染色对照 | 量子点功能化试剂盒 | Thermo Fisher | S10449 |
| Leica Stellaris 8 DIVE共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 超速离心 | 超速离心管 | -- | -- |
| 水平转子 | Beckman Coulter | SW60Ti | |
| 水平转子 | Beckman Coulter | SW32.1Ti | |
| SPR | Series S CM5 SPR芯片 | Cytiva | 29149603 |
| EDC | Life Technologies | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Life Technologies | 24510 | |
| 细胞培养 | I型胶原蛋白 | -- | -- |
| Normocin | -- | -- | |
| 高糖DMEM | Gibco | -- | |
| EquaFetal血清 | Atlas Biologicals | -- | |
| MEM | -- | -- | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX | -- | -- | |
| B-27补充剂 | -- | -- | |
| N-2补充剂 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | R&D Systems | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | PEPROTECH | -- | |
| NeuroCult化学解离试剂盒-小鼠 | Stemcell Technologies | -- | |
| 抗体 | CD63小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 67605-1-Ig |
| CD81兔多克隆抗体 | Proteintech | 27855-1-AP | |
| Glypican 1兔多克隆抗体 | Proteintech | 16700-1-AP | |
| CEA兔多克隆抗体 | Proteintech | 10421-1-AP | |
| 小鼠IgG1同型对照单克隆抗体 | Proteintech | 66360-1-Ig | |
| 磷酸化Tau181单克隆抗体 | Invitrogen | MN1050 | |
| Mab806抗体 | Creative Biolabs | TAB-228CL | |
| 鼠抗人CD9抗体 | Proteintech | 60232-1-Ig |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IJP制备 | 起始微球尺寸1.0 μm，金层厚度30 nm，沉积速率0.5 Å/s，最终IJP浓度1×10^8个/ml 阅读提示：Methods中IJP fabrication小节 |
| 抗体功能化 | 抗体浓度0.1 mg/ml，抗体与IJP混合比例，quencher反应时间 阅读提示：Methods中Antibody functionalization on IJP小节 |
| IJP与样本孵育 | IJP工作浓度1×10^7个/ml，样本与IJP比例2:1，孵育时间1小时 阅读提示：Methods中IJP fabrication和荧光成像小节 |
| 荧光成像 | 物镜10×，帧率10 Hz，视频时长60–180秒，焦距约220 μm 阅读提示：Methods中Fluorescence imaging of IJPs小节 |
| 临床样本检测 | 样本量87例，分组为健康33、AD 4、GBM 16、CRC 22、PDAC 15，检测时间<60分钟，盲法设计 阅读提示：Results中Rapid screening of different diseases using sEVs in human plasma小节及Fig 5 |
| 正交验证 | UC离心条件：12,000 × g 20分钟，167,000 × g 1.5小时，167,000 × g 4.5小时；SPR芯片型号Series S CM5，抗体浓度0.1 mg/ml 阅读提示：Methods中UC和SPR-based characterization小节 |