病毒分离与全基因组测序
从表现呼吸道症状的鸡中分离H6 AIVs并鉴定其基因组成。
采集咽喉拭子接种10日龄SPF鸡胚，收获尿囊液进行HA试验和RT-PCR筛选，阳性样本全基因组测序， plaque纯化获得六株H6分离株。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
新型出现的携带G57基因型H9N2内部基因的重配H6禽流感病毒具有潜在人兽共患风险
Novel emerging reassortant H6 avian influenza viruses with internal genes from G57 genotype of H9N2 pose potential zoonotic risk
实验完整度
高含体外细胞模型、反向遗传重配、小鼠和鸡体内攻毒及传播实验，并开展受体结合与聚合酶活性机制验证
主要模型
鸡和Houdan鸡咽喉拭子分离的H6N1/H6N2禽流感病毒 CEF、MDCK和A549细胞 BALB/c小鼠 10日龄SPF鸡
重点核对
病毒分离株：CZ56、CZ57、CZ58、CZ511、AH25107（H6N1）和NJ2501（H6N2） 细胞感染：CEF、MDCK和A549细胞，MOI为0.01，检测6、12、24、48和72 hpi病毒滴度 小鼠攻毒：5周龄BALB/c小鼠，每组11只，经鼻接种105 TCID50，监测14天体重和存活 鸡攻毒：10日龄SPF鸡，每组106只，经鼻接种0.1 mL，每组4只直接接触鸡，检测3和5 dpi气管和肺病毒滴度及2、4、6、8、10 dpi拭子排毒 反向遗传重配：rCZ56以XZ508（G57 H9N2）为骨架，含CZ56 HA，用于受体结合分析
摘要
近几十年来，中国家禽中出现了多种携带H9N2病毒内部基因的新型重配禽流感病毒（AIVs），并多次引起人类感染，凸显了H9N2内部基因盒在促进跨物种传播中的关键作用。本研究从表现呼吸道症状的鸡和Houdan鸡中分离到五株H6N1和一株H6N2 AIVs。遗传分析显示，这些H6 AIVs的血凝素（HA）基因属于ST339-like谱系，来源于中国家鹅中流行的H6 AIVs，而神经氨酸酶（NA）基因分别来源于H9N2或H5N1 AIVs。值得注意的是，这六株H6分离株的所有六个内部基因均来源于G57基因型H9N2病毒。体外研究表明，这些H6 AIVs在禽源和哺乳动物细胞中均能有效复制。H6N2分离株对禽样和人样受体均表现出双重受体结合亲和力，而五株H6N1病毒在体外试验条件下未检测到受体结合亲和力。反向遗传重配试验进一步揭示，H6N1 HA本身具有内在的双重受体结合亲和力。此外，这些H6分离株对小鼠表现出高毒力，并在鸡中诱导明显的呼吸道症状，且在禽类间有效传播。总之，我们的研究结果表明，携带G57 H9N2内部基因组合的H6 AIVs在鸡群中活跃传播，对家禽健康构成重大威胁，凸显了其对公共卫生的潜在风险以及在禽-人界面持续监测的必要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新出现的携带G57基因型H9N2内部基因的重配H6禽流感病毒是否具有跨物种传播和潜在人兽共患风险？
- 核心机制
- H6 AIVs通过重配获得G57基因型H9N2内部基因，可能增强病毒复制效率、聚合酶活性和对哺乳动物的适应性；H6N1 HA本身具有内在的双重受体结合亲和力。
- 主要证据
- 六株H6分离株全基因组测序显示HA来自鹅源H6、NA来自H9N2或H5N1、内部基因来自G57 H9N2；体外CEF、MDCK和A549细胞中有效复制；NJ2501表现双重受体结合，rCZ56重配病毒也显示双重结合；小鼠攻毒显示高毒力，鸡攻毒显示呼吸道症状和接触传播。
- 研究意义
- 研究表明H6 AIVs携带G57 H9N2内部基因组合在鸡群中活跃传播，对家禽健康构成威胁，并强调在禽-人界面持续监测的必要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
遗传演化与重配分析
追溯H6分离株各基因片段的进化来源和重配模式。
使用MAFFT、BEAST、MEGA 11等软件对HA、NA和内部基因进行系统发育分析，构建MCC树和邻接树。
分子特征分析
评估H6分离株与致病性、传播和耐药相关的关键氨基酸位点。
分析HA裂解位点、受体结合位点、PB2、PB1、PA、NP、M、NS1等蛋白的分子标记。
血凝与洗脱活性及NA活性检测
评估H6分离株的血凝能力和病毒释放特性。
使用鸡、鹅、火鸡和豚鼠红细胞进行血凝试验，鸡红细胞进行洗脱动力学试验，MUNANA为底物检测NA活性。
受体结合特异性分析
检测H6分离株对禽样和人样受体的结合能力。
使用Neu5Acα2-3Galb1-4GlcNAcb-sp3-PAA-biotin和Neu5Acα2-6Galb1-4GlcNAcb-sp3-PAA-biotin两种糖聚合物进行ELISA结合试验，并以反向遗传重配病毒rCZ56验证H6N1 HA的内在结合能力。
体外复制动力学与蚀斑试验
评估H6分离株在禽源和哺乳动物细胞中的复制能力。
在CEF、MDCK和A549细胞中感染H6病毒，检测不同时间点病毒滴度，并在MDCK细胞中进行蚀斑试验。
小鼠致病性实验
评估H6分离株对哺乳动物的致病性。
5周龄BALB/c小鼠经鼻接种H6病毒，监测体重和存活，检测鼻甲、肺和脑组织病毒滴度，并进行肺组织病理分析。
鸡致病性与传播实验
评估H6分离株在鸡中的致病性和接触传播能力。
10日龄SPF鸡经鼻接种H6病毒，引入未感染接触鸡，检测气管和肺病毒滴度及口咽和泄殖腔拭子排毒。
聚合酶活性检测
比较H6分离株与参考毒株的RNP聚合酶活性。
在293 T细胞中共转染荧光素酶报告质粒和RNP质粒，48 h后检测荧光素酶活性。
抗原性分析
评估H6分离株之间是否存在抗原漂移。
收集21 dpi剩余鸡血清，进行交叉血凝抑制试验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| NA活性检测 | 4-甲基伞形酮-N-乙酰神经氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 96孔黑色微孔板 | Thermo Fisher | -- | |
| BioTek Synergy-2酶标仪 | BioTek | -- | |
| 受体结合分析 | 禽样受体糖聚合物 | Glycitech | -- |
| 人样受体糖聚合物 | Glycitech | -- | |
| Pierce链霉亲和素高结合容量包被96孔板 | Pierce | -- | |
| H6特异性单克隆抗体4C2 | 本实验室制备 | -- | |
| HRP偶联抗鼠IgG抗体 | -- | -- | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| 病毒拯救 | pDP2002质粒 | -- | -- |
| ExnaseTM II重组酶 | -- | -- | |
| 聚合酶活性检测 | 双荧光素酶报告系统 | -- | -- |
| 细胞培养 | opti-MEM培养基 | -- | -- |
| TPCK-胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 蚀斑试验 | 0.1%结晶紫溶液 | -- | -- |
| 组织病理学 | 10%中性缓冲福尔马林 | -- | -- |
| 血凝抑制试验 | 0.5%红细胞 | -- | -- |
| 统计 | GraphPad 8软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒分离 | 样本来源：2025年中国表现呼吸道症状的鸡和Houdan鸡咽喉拭子；鸡胚：10日龄SPF鸡胚，孵育72 h 阅读提示：Methods中Viral isolation and identification小节 |
| 体外复制动力学 | 细胞系：CEF、MDCK、A549；MOI：0.01；维持液：opti-MEM含1 μg/mL TPCK-trypsin；采样时间：6、12、24、48、72 hpi；重复：三次 阅读提示：Methods中Viral growth kinetics小节及Figure 5图注 |
| 受体结合分析 | 糖聚合物：Neu5Acα2-3Galb1-4GlcNAcb-sp3-PAA-biotin和Neu5Acα2-6Galb1-4GlcNAcb-sp3-PAA-biotin；浓度：5、0.2、0.008 μg/mL；病毒用量：64 HAU；检测抗体：4C2 阅读提示：Methods中Receptor binding preference analysis小节及Figure 4图注 |
| 小鼠攻毒 | 小鼠：5周龄BALB/c，每组11只；接种剂量：105 TCID50/25 μL，经鼻；监测14天；3和5 dpi各安乐死3只采样；安乐死标准：体重下降超过25% 阅读提示：Methods中Mouse challenge study小节及Figure 6图注 |
| 鸡攻毒与传播 | 鸡：10日龄SPF，每组106只，经鼻接种0.1 mL；接触鸡：每组4只；3和5 dpi各安乐死3只；口咽和泄殖腔拭子采集时间：2、4、6、8、10 dpi 阅读提示：Methods中Chicken challenge study小节及Figure 8图注 |
| 聚合酶活性检测 | 细胞：293 T；质粒：p-Luci、RNP质粒、Renilla内参；检测时间：48 h；重复：三次 阅读提示：Methods中Luciferase assay for polymerase activity小节及Figure 7图注 |
| 反向遗传重配 | 骨架：A/chicken/Xuzhou/508/2019(H9N2)（XZ508）；HA来源：CZ56；转染细胞：293 T和MDCK共培养；收毒时间：转染后3天 阅读提示：Methods中Plasmid construction and virus rescue小节及Supplementary Figure 2 |