食蟹猴角膜上皮损伤模型建立
构建不同修复阶段的角膜上皮创伤模型以获取时序性组织样本
对食蟹猴进行麻醉后，使用AlgerBrush II进行360度浅层角膜切除，创建直径约6 mm、距角膜缘2 mm的标准化圆形创面；将6只猴随机分为3组：未损伤对照（第0天）和伤后第1天、第3天安乐死组
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长读长单细胞RNA测序揭示食蟹猴角膜上皮创伤愈合过程中的动态异构体变化
Long-Read Single-Cell RNA Sequencing Reveals Dynamic Isoform Changes During Corneal Epithelial Wound Healing in Cynomolgus Monkeys
实验完整度
高含单细胞长读长测序、生物信息学分析及RT-qPCR、RNA-FISH独立实验验证，覆盖体外与组织模型
主要模型
食蟹猴角膜缘组织（未损伤及损伤后1天、3天） HCE-T细胞划痕损伤模型 食蟹猴角膜组织切片
重点核对
HIT-scISOseq检测全长转录本，每个时间点2个生物学重复 在HCE-T细胞划痕实验中于0、6、12小时收集样本进行RT-qPCR验证（n=4） RNA-FISH使用异构体特异性探针在未损伤食蟹猴角膜组织中进行空间定位验证 差异表达分析阈值：|avg_log2FC|>0.50且调整P值<0.05 异构体使用变化阈值：|ΔPSI|>20%且PSI的CV<0.2
摘要
目的：角膜上皮创伤愈合对损伤后视力恢复至关重要，但其分子机制仍未被完全理解。同一基因产生的不同RNA异构体可能具有基因水平分析无法捕捉的不同功能。本研究利用长读长单细胞RNA测序（RNA-seq）表征食蟹猴角膜上皮创伤愈合过程中异构体水平的转录变化。方法：我们使用HIT-scISOseq（一种检测全长转录本的长读长单细胞方法）对未损伤状态以及损伤后1天和3天的食蟹猴角膜缘组织进行了分析。生物信息学分析检查了上皮细胞群体中的差异异构体表达、使用、多样性和转换。关键异构体在划痕损伤的HCE-T细胞中通过RT-qPCR验证，并在猴角膜组织中通过RNA-FISH验证。结果：分析揭示了角膜上皮修复过程中广泛的异构体水平变化，这些变化仅从基因表达中无法看出。细胞骨架重塑基因（TPM1和DST）和应激反应基因（ERICH5和CTSL）尽管总表达相对稳定，但显示出异构体使用改变。ARID5B和GSN在修复阶段表现出细胞类型特异性的异构体转换。我们鉴定了27个具有动态异构体多样性变化的基因和62个具有显著异构体转换的基因。RT-qPCR和RNA-FISH验证证实了损伤诱导的表达动态以及关键异构体的细胞类型特异性定位。结论：异构体水平调控代表了角膜上皮创伤愈合过程中一个重要的、独立的转录控制层。该单细胞异构体图谱为识别损伤相关转录本和候选调控通路提供了资源，为未来的功能研究和以异构体为靶点的治疗策略提供了框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 角膜上皮创伤愈合过程中是否存在基因水平分析无法捕捉的异构体水平转录变化，以及这些变化是否具有细胞类型和修复阶段特异性。
- 核心机制
- 异构体水平调控构成角膜上皮创伤愈合中独立于基因表达的转录控制层，通过异构体使用改变、多样性调节和异构体转换精细调控细胞骨架重塑、应激反应、增殖和分化等修复过程。
- 主要证据
- 在食蟹猴角膜缘组织损伤后1天和3天，长读长单细胞RNA测序检测到797和711个差异表达异构体，鉴定出27个异构体多样性变化基因和62个异构体转换基因，并发现TPM1、ERICH5、DST、CTSL等基因异构体使用改变而总表达稳定；RT-qPCR在HCE-T划痕模型中验证了3个异构体的上调，RNA-FISH验证了DSG1异构体和Transcript16407.8的空间定位。
- 研究意义
- 提供了角膜上皮早期创伤愈合的单细胞异构体图谱，确立RNA异构体调控为一个重要且此前未被充分探索的转录后控制层，为未来功能研究和以异构体为靶点的治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
角膜缘组织解离与单细胞悬液制备
获取高质量单细胞用于长读长单细胞RNA测序
切取2 mm × 2 mm角膜缘组织，深度100 µm，使用Dispase II和IV型胶原酶37°C旋转消化；分离上皮层后用1 mg/mL胶原酶A在含10% FBS、50 µg/mL gentamicin和1.25 µg/mL amphotericin B的DMEM中37°C消化2小时；再用0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA解离，经30-µm滤网过滤，重悬于含0.04% BSA的PBS至1000 cells/µL
10 × Genomics单细胞捕获与长读长测序
获取单细胞全长转录本数据以分析异构体水平表达
使用10 × Genomics Chromium平台进行单细胞捕获，每个样本约回收2000个细胞；生成单细胞全长cDNA后，按照HIT-scISOseq方案构建文库并测序；每个时间点2个生物学重复
生物信息学分析鉴定异构体水平变化
识别细胞类型特异性异构体表达、使用、多样性和转换
使用scISA-Tools分配barcode，IsoQuant进行比对和异构体鉴定；Seurat（v4.3.0）进行归一化、CCA批次校正、PCA和聚类；Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达异构体；PSI分析鉴定异构体使用变化；Shannon熵计算异构体多样性指数；IsoDiffR鉴定异构体转换
RT-qPCR验证关键异构体表达动态
在体外角膜上皮损伤模型中验证测序鉴定的关键异构体表达变化
使用HCE-T细胞划痕损伤模型，在0、6、12小时收集样本提取RNA，使用异构体特异性引物进行RT-qPCR，以GAPDH为内参，2^−ΔΔCt法计算相对表达
RNA-FISH验证异构体空间定位
验证关键异构体在角膜组织中的细胞类型特异性空间定位
未损伤食蟹猴角膜组织经4%多聚甲醛固定、30%蔗糖/PBS平衡、OCT包埋后切片（10 µm）；使用FISH检测试剂盒（GF006）与定制异构体特异性探针在40°C杂交16小时；随后用抗K12抗体（1:100）和二抗（1:500）免疫染色，DAPI复染，Zeiss LSM 980共聚焦显微镜成像
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 局部眼麻醉 | 0.5%盐酸丙美卡因 | Alcon | -- |
| 角膜上皮损伤 | AlgerBrush II角膜上皮刮除器 | -- | -- |
| 组织解离 | 中性蛋白酶II | Sigma | -- |
| IV型胶原酶 | Sigma | -- | |
| 胶原酶A | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | Advanced DMEM/F-12培养基 | -- | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 单细胞捕获 | Chromium控制器 | 10 × Genomics | -- |
| Chromium单细胞3′ GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10 × Genomics | PN-1000075 | |
| 组织固定与包埋 | 蔗糖 | -- | -- |
| 最佳切割温度包埋剂 | -- | -- | |
| RNA-FISH | FISH检测试剂盒 | Servicebio | GF006 |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 抗角蛋白12抗体 | Abcam | ab185627 | |
| 二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| DAPI | -- | -- | |
| RNA-FISH成像 | Zeiss LSM 980共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞培养 | 胰岛素 | -- | -- |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | -- |
| 逆转录 | EasyScript一步法gDNA去除与cDNA合成预混液 | Transgene Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 动物种属（食蟹猴）、年龄（4岁）、性别（雌性）、每组动物数量（6只分3组）、损伤时间点（第0、1、3天） 阅读提示：Methods中Corneal Epithelial Wounds小节及Supplementary Fig. 1A |
| 角膜损伤模型 | 麻醉剂（ketamine/xylazine）、局部麻醉剂（0.5% proparacaine hydrochloride/Alcaine, Alcon）、器械（AlgerBrush II）、创面大小（约6 mm直径）、位置（距角膜缘2 mm） 阅读提示：Methods中Corneal Epithelial Wounds小节 |
| 组织解离与单细胞悬液制备 | 组织大小（2 mm × 2 mm）、深度（100 µm）、消化酶（Dispase II、collagenase IV、collagenase A）、浓度（1 mg/mL collagenase A）、温度与时间（37°C，2小时）、过滤（30-µm）、细胞浓度（1000 cells/µL） 阅读提示：Methods中Tissue Dissociation小节 |
| 长读长单细胞测序 | 平台（10 × Genomics Chromium）、试剂盒版本（Chromium Single Cell 3′ Kit v3, PN-1000075）、每个样本回收细胞数（约2000）、每个时间点生物学重复数（2个）、测序方案（HIT-scISOseq） 阅读提示：Methods中10 × Genomics Single-Cell Capture和Long-Read Single-Cell RNA Sequencing小节及Figure 1A |
| RT-qPCR验证 | 细胞模型（HCE-T）、划痕后收集时间点（0、6、12小时）、独立实验次数（n=4）、内参基因（GAPDH）、定量方法（2^−ΔΔCt）、引物序列（Supplementary Table S7） 阅读提示：Methods中Corneal Epithelial Cell Culture and Scratch Assay、RNA Extraction and Quantitative Real-Time PCR小节及Figure 3D |
| RNA-FISH验证 | 组织类型（未损伤食蟹猴角膜）、切片厚度（10 µm）、FISH试剂盒（GF006, Servicebio）、探针杂交温度与时间（40°C，16小时）、抗体（anti-Keratin 12 ab185627, 1:100；二抗A-21428, 1:500）、成像设备（Zeiss LSM 980） 阅读提示：Methods中Immunofluorescence Staining and Fluorescence In Situ Hybridization小节及Figure 3B，探针序列见Supplementary Table S6 |
| 生物信息学分析参数 | 软件版本（Seurat v4.3.0）、批次校正方法（CCA）、差异表达阈值（|avg_log2FC| > 0.50，调整P值 < 0.05）、PSI阈值（|ΔPSI| > 20%，CV < 0.2）、多样性阈值（|ΔDI| > 0.2） 阅读提示：Methods中Data Processing and Downstream Analysis、Differentially Expressed Analysis、Isoform Usage Analysis、Isoform Diversity Analysis、Isoform Switch Analysis小节 |