人体EOM及神经组织采集与固定
获取适用于免疫荧光和电镜分析的新鲜人眼外肌及运动神经样本
从3名遗体供体提取眼球及眼外肌,取动眼、滑车、外展神经各三个位置1 cm段,4%多聚甲醛固定24小时,蔗糖梯度冷冻保护,包埋后冷冻切片或制备150 µm漂浮切片
Structural and Molecular Features of Human Extraocular Muscle Spindles Suggest a Unique Role in Proprioception
含人体EOM与神经样本、猪EOM及2岁儿童EOM,多色免疫荧光、TEM与3D重建,含分子与神经走行验证
3名人体供体(69、92、93岁)的EOMs及动眼、滑车、外展神经 2岁儿童EOMs(TEM及既往研究数据) 猪EOMs(既往研究数据,用于3D重建与比较)
人体供体3名,年龄69、92、93岁,死亡后6至8小时内送达解剖科,固定开始于死后7至10小时 共分析54个肌梭:下直肌25个、内直肌24个、下斜肌5个 抗体工作浓度及货号见表:如anti-NF 1:2000、anti-ChAT 1:100、anti-Syn 1:300、anti-VGLUT1 1:500、anti-MYL2 1:200、anti-GLUT1 1:500、phalloidin 1:200、α-bungarotoxin 1:500 神经取样三个位置:脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处 统计学显著性设定为P < 0.05,采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取适用于免疫荧光和电镜分析的新鲜人眼外肌及运动神经样本
从3名遗体供体提取眼球及眼外肌,取动眼、滑车、外展神经各三个位置1 cm段,4%多聚甲醛固定24小时,蔗糖梯度冷冻保护,包埋后冷冻切片或制备150 µm漂浮切片
确定人EOM肌梭的结构特征及GLUT1、MYL2等组织分子表达
对肌梭切片和全mount进行多色免疫荧光,标记GLUT1、MYL2、Phalloidin、NF、DAPI,共聚焦显微镜成像,测量肌梭直径、囊长、纤维直径和数量
区分肌梭内感觉和运动神经纤维及末梢
双标NF/ChAT、Syn/NF、BTX/GLUT1等,观察神经入口、ChAT阳性运动纤维走向极区、ChAT阴性感觉纤维在中央区盘绕及Syn阳性末梢分布
检测感觉末梢是否具备谷氨酸能突触传递的分子机制
免疫荧光标记VGLUT1、synaptobrevin、syntaxin、complexin,结合GLUT1、Phalloidin或NF,观察感觉末梢表达;TEM观察清亮囊泡和突触 cleft 基膜
检验本体感觉纤维是否通过EOM运动神经到达脑干
对动眼、滑车、外展神经三个位置(脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处)进行ChAT和TH免疫荧光,分析ChAT阴性纤维的存在及TH表达
比较人和猪EOM肌梭感觉末梢的空间构型差异
将抗NF和抗Syn标记的共聚焦图像栈导入Amira 2025.1进行体积渲染,生成3D重建;猪EOM肌梭数据来自既往研究
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 抗神经丝蛋白抗体 | Merck/Millipore | AB5539/AB_177520 |
| 抗胆碱乙酰转移酶抗体 | Merck/Millipore | AB144P/AB_2079751 | |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Sigma Aldrich | AB152/AB_390204 | |
| 抗突触素抗体 | Merck/Millipore | MAB329/AB_95786 | |
| 抗synaptobrevin抗体 | Synaptic System | AB104002/AB_887807 | |
| 抗complexin抗体 | Synaptic System | 122003/AB_2619793 | |
| 抗syntaxin抗体 | Synaptic System | 110403/AB_887900 | |
| 抗囊泡谷氨酸转运体1抗体 | Synaptic System | 135303/AB_887875 | |
| 抗肌球蛋白轻链2抗体 | ABCAM | AB79935/AB_1952220 | |
| 抗葡萄糖转运蛋白1抗体 | Proteintech | 66290-1-Ig/AB2881673 | |
| 抗葡萄糖转运蛋白1抗体 | ABCAM | AB115730/AB115730 | |
| 鬼笔环肽 | Sigma-Aldrich | 65906-10NMOL | |
| α-银环蛇毒素 | Thermo Fisher | B35450 | |
| 组织包埋与切片 | 冷冻包埋剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | Superfrost Ultra Plus载玻片 | Thermo Fisher | -- |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 568标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 647标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 荧光封片剂 | Dako | -- | |
| 图像采集 | 共聚焦激光扫描显微镜FV3000 | Olympus | -- |
| 电镜 | 透射电子显微镜EM9 | Zeiss | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人体组织采集与固定 | 供体数量3名,年龄69、92、93岁,死亡后6至8小时内送达,固定开始于死后7至10小时;固定液4%多聚甲醛0.1 M PBS pH 7.4,4°C 24小时 阅读提示:Materials and Methods中Tissue Collection小节 |
| 肌梭样本量及分布 | 共分析54个肌梭:下直肌25个、内直肌24个、下斜肌5个;详见Supplementary Table S1 阅读提示:Results第一段及Supplementary Table S1 |
| 免疫荧光条件 | 各一抗工作浓度和货号见Table;一抗孵育24小时4°C(ChAT 48小时);二抗1:500,37°C 2小时;DAPI复染10分钟 阅读提示:Materials and Methods中Antibodies and Labeling Toxins及Immunofluorescence Labeling小节,Table |
| 神经取样位置 | 动眼、滑车、外展神经各取三个1 cm段:脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处 阅读提示:Materials and Methods中Tissue Collection小节及Figure 5A |
| TEM样本来源与处理 | 使用2岁多器官供体EOMs;固定液2%多聚甲醛+2.5%戊二醛0.1 M二甲砷酸盐缓冲液pH 7.4,1天;1%锇酸后固定;Epon包埋;2%醋酸铀和0.4%柠檬酸铅染色 阅读提示:Materials and Methods中Transmission Electron Microscopy小节 |
| 3D重建条件 | 共聚焦图像栈标记抗NF和抗Syn;使用Amira 2025.1体积渲染模块;猪EOM数据来自既往研究 阅读提示:Materials and Methods中Three-Dimensional Image Reconstruction小节 |