人眼外肌肌梭的结构与分子特征提示其在本体感觉中的独特作用

Structural and Molecular Features of Human Extraocular Muscle Spindles Suggest a Unique Role in Proprioception

作者信息Arzu Petersen, Paata Pruidze, Giorgi Didava, Atieh Seyedian Moghaddam, Stefan H Geyer, Génova Carrero-Rojas, Angel M Pastor, Wolfgang J Weninger, Roland Blumer
PMID42742214
发布时间2026-09-01
DOI10.1167/iovs.67.11.27

实验完整度

含人体EOM与神经样本、猪EOM及2岁儿童EOM,多色免疫荧光、TEM与3D重建,含分子与神经走行验证

主要模型

3名人体供体(69、92、93岁)的EOMs及动眼、滑车、外展神经 2岁儿童EOMs(TEM及既往研究数据) 猪EOMs(既往研究数据,用于3D重建与比较)

重点核对

人体供体3名,年龄69、92、93岁,死亡后6至8小时内送达解剖科,固定开始于死后7至10小时 共分析54个肌梭:下直肌25个、内直肌24个、下斜肌5个 抗体工作浓度及货号见表:如anti-NF 1:2000、anti-ChAT 1:100、anti-Syn 1:300、anti-VGLUT1 1:500、anti-MYL2 1:200、anti-GLUT1 1:500、phalloidin 1:200、α-bungarotoxin 1:500 神经取样三个位置:脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处 统计学显著性设定为P < 0.05,采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验

摘要

目的:人眼外肌(EOMs)中的肌梭表现出非典型特征,使其功能受到质疑。我们检测了先前在骨骼肌肌梭中描述过的分子在人EOM肌梭中的存在情况。我们还研究了本体感觉纤维在EOM运动神经内的解剖走行。方法:EOMs和EOM神经取自三名个体(平均年龄84.7 ± 13.6岁)。我们还使用了两项独立研究的数据,包括一名2岁儿童的EOMs和猪EOMs。分析中,我们整合了多色免疫荧光、共聚焦3D重建和透射电子显微镜(TEM)。结果:人EOM肌梭含有核链纤维和类似梭外肌纤维的梭内纤维。只有核链纤维表达肌球蛋白轻链2。肌梭囊表达葡萄糖转运蛋白1。肌梭的感觉神经末梢含有清亮囊泡,这通过突触素表达得到证实。这些末梢还表达囊泡谷氨酸转运体,表明储存神经递质谷氨酸。此外,感觉神经末梢表达syntaxin、complexin和synaptobrevin,这些是参与神经递质释放的蛋白。感觉(本体感觉)纤维不存在于EOM运动神经从脑干发出的出口处。它们在眶上裂处与EOM运动神经汇合。结论:我们的研究揭示了人EOM肌梭中存在谷氨酸能机制,与骨骼肌肌梭类似。这些发现不支持人EOM肌梭是退化结构的假说。相反,它们提示肌梭是有功能的,提供关于眼位置的回馈。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
人EOM肌梭是否具有功能,其分子特征和本体感觉纤维走行如何?
核心机制
人EOM肌梭感觉末梢表达VGLUT1、synaptobrevin、syntaxin和complexin,具备储存和释放谷氨酸的分子机制,类似骨骼肌肌梭。
主要证据
多色免疫荧光显示核链纤维表达MYL2,肌梭囊表达GLUT1,感觉末梢表达VGLUT1、Syn、SYB、STX、CPLX;TEM显示感觉末梢含清亮囊泡且突触 cleft 无基膜;神经染色显示ChAT阴性/TH阴性感觉纤维在眶上裂汇入运动神经。
研究意义
研究结果不支持人EOM肌梭是退化结构的假说,提示其为有功能的牵张感受器,提供眼位置的强直性本体感觉信号。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

人体EOM及神经组织采集与固定

获取适用于免疫荧光和电镜分析的新鲜人眼外肌及运动神经样本

从3名遗体供体提取眼球及眼外肌,取动眼、滑车、外展神经各三个位置1 cm段,4%多聚甲醛固定24小时,蔗糖梯度冷冻保护,包埋后冷冻切片或制备150 µm漂浮切片

2

肌梭形态与组织蛋白免疫荧光分析

确定人EOM肌梭的结构特征及GLUT1、MYL2等组织分子表达

对肌梭切片和全mount进行多色免疫荧光,标记GLUT1、MYL2、Phalloidin、NF、DAPI,共聚焦显微镜成像,测量肌梭直径、囊长、纤维直径和数量

3

感觉与运动神经支配的免疫荧光分析

区分肌梭内感觉和运动神经纤维及末梢

双标NF/ChAT、Syn/NF、BTX/GLUT1等,观察神经入口、ChAT阳性运动纤维走向极区、ChAT阴性感觉纤维在中央区盘绕及Syn阳性末梢分布

4

感觉末梢突触囊泡及突触前蛋白检测

检测感觉末梢是否具备谷氨酸能突触传递的分子机制

免疫荧光标记VGLUT1、synaptobrevin、syntaxin、complexin,结合GLUT1、Phalloidin或NF,观察感觉末梢表达;TEM观察清亮囊泡和突触 cleft 基膜

5

本体感觉纤维在EOM运动神经内的走行分析

检验本体感觉纤维是否通过EOM运动神经到达脑干

对动眼、滑车、外展神经三个位置(脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处)进行ChAT和TH免疫荧光,分析ChAT阴性纤维的存在及TH表达

6

人及猪EOM肌梭感觉末梢3D重建与比较

比较人和猪EOM肌梭感觉末梢的空间构型差异

将抗NF和抗Syn标记的共聚焦图像栈导入Amira 2025.1进行体积渲染,生成3D重建;猪EOM肌梭数据来自既往研究

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗神经丝蛋白抗体Merck/MilliporeAB5539/AB_177520
抗胆碱乙酰转移酶抗体Merck/MilliporeAB144P/AB_2079751
抗酪氨酸羟化酶抗体Sigma AldrichAB152/AB_390204
抗突触素抗体Merck/MilliporeMAB329/AB_95786
抗synaptobrevin抗体Synaptic SystemAB104002/AB_887807
抗complexin抗体Synaptic System122003/AB_2619793
抗syntaxin抗体Synaptic System110403/AB_887900
抗囊泡谷氨酸转运体1抗体Synaptic System135303/AB_887875
抗肌球蛋白轻链2抗体ABCAMAB79935/AB_1952220
抗葡萄糖转运蛋白1抗体Proteintech66290-1-Ig/AB2881673
抗葡萄糖转运蛋白1抗体ABCAMAB115730/AB115730
鬼笔环肽Sigma-Aldrich65906-10NMOL
α-银环蛇毒素Thermo FisherB35450
冷冻包埋剂Thermo Fisher Scientific--
Superfrost Ultra Plus载玻片Thermo Fisher--
Alexa Fluor 488标记二抗Thermo Fisher Scientific--
Alexa Fluor 568标记二抗Thermo Fisher Scientific--
Alexa Fluor 647标记二抗Thermo Fisher Scientific--
荧光封片剂Dako--
共聚焦激光扫描显微镜FV3000Olympus--
透射电子显微镜EM9Zeiss--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
人体组织采集与固定
供体数量3名,年龄69、92、93岁,死亡后6至8小时内送达,固定开始于死后7至10小时;固定液4%多聚甲醛0.1 M PBS pH 7.4,4°C 24小时
阅读提示:Materials and Methods中Tissue Collection小节
肌梭样本量及分布
共分析54个肌梭:下直肌25个、内直肌24个、下斜肌5个;详见Supplementary Table S1
阅读提示:Results第一段及Supplementary Table S1
免疫荧光条件
各一抗工作浓度和货号见Table;一抗孵育24小时4°C(ChAT 48小时);二抗1:500,37°C 2小时;DAPI复染10分钟
阅读提示:Materials and Methods中Antibodies and Labeling Toxins及Immunofluorescence Labeling小节,Table
神经取样位置
动眼、滑车、外展神经各取三个1 cm段:脑干出口、海绵窦中段、眶上裂入眶处
阅读提示:Materials and Methods中Tissue Collection小节及Figure 5A
TEM样本来源与处理
使用2岁多器官供体EOMs;固定液2%多聚甲醛+2.5%戊二醛0.1 M二甲砷酸盐缓冲液pH 7.4,1天;1%锇酸后固定;Epon包埋;2%醋酸铀和0.4%柠檬酸铅染色
阅读提示:Materials and Methods中Transmission Electron Microscopy小节
3D重建条件
共聚焦图像栈标记抗NF和抗Syn;使用Amira 2025.1体积渲染模块;猪EOM数据来自既往研究
阅读提示:Materials and Methods中Three-Dimensional Image Reconstruction小节