组织样本采集与患者分组
获取子宫内膜异位症病灶、腹膜和在位子宫内膜及对照子宫内膜，用于后续测序和比较。
在IRB批准下，从接受子宫内膜异位症手术的患者及因子宫肌瘤手术且无子宫内膜异位症手术证据的对照患者中采集新鲜或速冻组织；从同一患者三个部位获取在位子宫内膜、腹膜组织和异位病灶，并在显微镜下分离病灶与下方腹膜组织。
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子宫内膜异位症病灶颜色相关的转录组差异及癌症突变
Transcriptome differences in lesions by color, and cancer mutations in endometriosis
实验完整度
中对25例患者51份组织行bulk RNA-seq，含差异表达、共享及体细胞突变分析和ARID1A计算建模，但无功能验证
主要模型
子宫内膜异位症患者病灶组织 在位子宫内膜活检组织 病灶下腹膜组织 对照患者子宫内膜活检组织
重点核对
队列构成：20例子宫内膜异位症患者和5例对照患者；10例患者的在位子宫内膜、腹膜和病灶组成triad 组织纳入标准：经病理学家确认的子宫内膜异位症浅表腹膜病灶，病灶大小足以行切除手术和显微切割；镜下混合来源组织被排除 测序条件：RNA integrity score >6.5；共18个子宫内膜异位病灶、12份病灶下腹膜、17份患者子宫内膜和5份对照子宫内膜通过质控并测序 差异表达阈值：Padj < 0.05，log2FoldChange > 1.5；网络分析使用log2FoldChange > 1.5且Padj < 0.05 体细胞变异筛选：Mutect2，过滤read orientation artifacts并保留genotype count大于10
摘要
子宫内膜异位症是一种类似子宫内膜的细胞在子宫外生长、嵌入腹腔组织和器官、形成病灶并引起疼痛和不孕的疾病。既往在子宫内膜异位症患者中鉴定出与疾病相关的单核苷酸多态性，以及癌症相关基因中的体细胞突变。本研究使用bulk RNA测序，检测子宫内膜异位症患者和对照患者子宫内膜异位病灶、腹膜和在位子宫内膜的转录组突变谱及差异表达基因。差异基因表达分析显示，病灶转录组因颜色不同而存在差异，具体表现为红色病灶相比透明病灶炎症过程增加。此外，与在位子宫内膜相比，病灶中细胞增殖和雌激素反应基因表达增加。我们在无癌症的子宫内膜异位症患者中鉴定到癌症相关基因ARID1A、KRAS、PIK3CA、ARHGAP35和PBRM1的体细胞突变发生增加，这些突变在病灶、腹膜和在位子宫内膜之间保守。这些源自在位子宫内膜的突变可能在该病的发生和进展中起作用。重要的是，我们的发现提示，手术中切除可见的子宫内膜异位病灶组织可能不足以完全清除病灶，从而导致复发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 将转录组突变谱与差异转录表达分析结合，是否能为浅表腹膜子宫内膜异位病灶的病因和发生提供新的认识，并揭示与相关生物学通路的更多关联。
- 核心机制
- 源自在位子宫内膜的癌症相关基因体细胞突变可能参与疾病的发生和进展；病灶与腹膜共享癌症基因变异提示子宫内膜异位组织可能超出可见病灶扩散。
- 主要证据
- 对20例患者和5例对照的51份组织进行bulk RNA测序；差异表达显示红色病灶较透明病灶炎症过程增加，病灶较在位子宫内膜细胞增殖和雌激素反应基因增加；共享和体细胞变异分析鉴定ARID1A、KRAS、PIK3CA、ARHGAP35、PBRM1等癌症相关基因突变；ARID1A错义突变计算机建模提示功能丧失。
- 研究意义
- 提示手术中切除可见的子宫内膜异位病灶组织可能不足以完全清除病灶，从而导致复发；病灶颜色相关转录差异可能促进针对患者个体化病灶表型的治疗开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA提取与bulk RNA测序
获得病灶、腹膜和子宫内膜组织的转录组数据，用于突变检测和差异表达分析。
通过bead-based capture分离总RNA，纯化并确认RNA integrity score，对通过内部质控的组织进行全转录组测序；构建paired-end文库并在Illumina NovaSeq 6000平台测序。
共享变异注释
鉴定同一患者不同组织类型共享的SNP/Indel变异，并注释其影响。
使用GATK RNA-seq short variant discovery workflow v4调用共享变异，使用Ensembl VEP注释，并与299个癌症驱动基因列表比较，使用IGV验证。
体细胞变异注释
鉴定主要存在于病灶组织中的体细胞突变，以在位子宫内膜作为正常对照。
使用GATK Somatic short variant pipeline with Mutect2，将在位子宫内膜作为normal、病灶作为tumor进行体细胞突变调用，过滤后使用VEP注释并用GenVisR可视化。
差异基因表达分析
比较红色与透明病灶、以及病灶与在位子宫内膜之间的转录表达差异。
使用STAR aligner 2.7.9a比对read counts，DESeq2进行差异表达分析，R 4.1.1进行PCA；使用ClusterProfiler进行Gene Ontology和KEGG通路富集，使用fGSEA和Hallmark数据集进行GSEA。
ARID1A蛋白建模
探索ARID1A错义突变对SWI/SNF复合物结构和功能的潜在影响。
使用Schrodinger PyMOL基于实验结构PDBID 6LTH对人类BAF（SWI/SNF）复合物进行计算建模，并进行ARID1A计算突变以可视化空间冲突；使用SIFT和PolyPhen2预测功能影响。
网络分析
理解癌症驱动基因体细胞变异与病灶转录表达之间的关联。
基于10例triad样本中medium和high impact变异净数构建排序基因列表，与基于差异表达结果的排序基因列表比较；使用GePHI可视化，互动信息来自STRING数据库。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA-seq文库构建 | NEB II Ultra RNA文库制备试剂盒 | New England Biolab | -- |
| RNA测序 | NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| ARID1A蛋白建模 | PyMOL 2.0 | Schrodinger | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本采集与患者分组 | 疾病队列纳入标准为病理学家确认的子宫内膜异位症浅表腹膜病灶且病灶大小足以行切除手术和显微切割；对照为手术确认子宫肌瘤且无子宫内膜异位症手术证据；病灶与下方腹膜需在显微镜下分离，混合来源组织被排除 阅读提示：Methods中Tissue sample and patient selection小节；Table 1记录患者年龄、BMI、分期、组织类型和病灶位置 |
| RNA提取与bulk RNA测序 | RNA integrity score需大于6.5；仅51/112份组织通过质控；实际测序为18个病灶、12份腹膜、17份患者子宫内膜和5份对照子宫内膜；测序平台为Illumina NovaSeq 6000，S2和SP芯片，平均47.2 million mapped paired-end reads，2 × 100bp 阅读提示：Methods中Whole transcriptome sequencing小节；Figure 1展示样本收集、测序和分析流程 |
| 差异基因表达分析 | 差异表达阈值Padj < 0.05且log2FoldChange > 1.5；红色vs透明病灶比较和病灶vs在位子宫内膜比较所用样本范围不同；PCA在R 4.1.1中进行；GSEA使用Hallmark数据集和DESeq2 stat变量 阅读提示：Methods中Differential gene expression analysis小节；Figure 2和图3对应图注 |
| 共享变异与体细胞变异分析 | 共享变异使用GATK RNA-seq short variant discovery workflow v4和VEP注释，并与299个癌症驱动基因列表比较；体细胞变异使用Mutect2，以在位子宫内膜为normal、病灶为tumor，过滤read orientation artifacts并保留genotype count大于10 阅读提示：Methods中Shared variant annotation和Somatic variant annotation小节；Figure 4、Figure 5及Supplementary Figures |
| ARID1A蛋白建模 | 使用PDBID 6LTH和PyMOL version 2.0；建模三个ARID1A错义突变G1848V、R1528Q和P550H；SIFT和PolyPhen2用于预测功能影响 阅读提示：Methods中ARID1A protein modeling小节；Figure 6及图注 |