检测IAV感染对ATG13表达的影响及ATG13对病毒复制的作用
确定ATG13在IAV感染中的表达变化及其对病毒复制的影响。
HEK-293T、A549、THP-1细胞感染H9N2-IAV或H1N1-IAV，通过Western blot检测ATG13表达；过表达ATG13（Flag-ATG13）或敲低/敲除ATG13后感染病毒，TCID50测定病毒滴度。
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ATG13通过ASB1促进MAVS的K63连接多聚泛素化以限制甲型流感病毒复制
ATG13 promotes K63-linked polyubiquitination of MAVS via ASB1 to restrict influenza A virus replication
实验完整度
高多细胞模型（HEK-293T、A549、THP-1）及MAVS-/-细胞、Co-IP、泛素化、SDD-AGE、双荧光素酶、ELISA、病毒滴度等功能和机制验证
主要模型
HEK-293T细胞 A549细胞 THP-1细胞（WT与ATG13-KO） MAVS-/- HEK-293T细胞
重点核对
H9N2-IAV（A/chicken/Hong Kong/G9/1997）和H1N1-IAV（A/Puerto Rico/8/34）感染，MOI=0.1或1，感染时间12–36 h ATG13过表达（HEK-293T: 800 ng；A549: 1000 ng或1 μg）及ShATG13或ATG13-KO敲低/敲除模型 ATG13招募ASB1：ASB1结合ATG13并促进MAVS K63连接多聚泛素化，K348R突变消除该修饰及IFN-β/ISRE报告基因激活 ATG13非自噬依赖性：3-MA（10 mM）处理6 h及PLBDmut、HDmut仍增强MAVS报告基因活性 TCID50测定病毒滴度，数据基于三次独立实验，采用Reed–Muench法计算
摘要
自噬相关蛋白13（ATG13）在调控自噬起始复合物组装中发挥关键作用。然而，ATG13在流感病毒感染过程中的功能和作用机制仍不完全清楚。本研究表明，ATG13限制甲型流感病毒（IAV）复制，同时增强I型干扰素（IFN-I）通路的激活。机制上，免疫共沉淀实验揭示ATG13与MAVS相互作用，并招募E3泛素连接酶ASB1，催化MAVS第K348位赖氨酸残基的K63连接多聚泛素化，从而放大下游抗病毒信号级联。此外，通过双荧光素酶报告实验和自噬的药理学抑制，我们证实ATG13这一新型免疫调节功能不依赖于经典自噬通路。本研究将ATG13鉴定为一种新型抗IAV宿主限制因子，并揭示ATG13在抗病毒天然免疫中的非自噬功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATG13在甲型流感病毒感染中的功能及其调控I型干扰素通路的分子机制尚不清楚，本研究旨在阐明ATG13是否及如何限制IAV复制。
- 核心机制
- ATG13与MAVS相互作用并招募E3泛素连接酶ASB1，催化MAVS K348位点的K63连接多聚泛素化，增强MAVS寡聚化及下游信号，从而激活I型干扰素通路；该功能不依赖于经典自噬通路。
- 主要证据
- 在HEK-293T、A549和THP-1细胞中，ATG13过表达降低H9N2和H1N1病毒滴度并增强IFN-β、ISGs表达及IRF3磷酸化，ATG13敲低/敲除则相反；Co-IP证实ATG13与MAVS和TRAF3相互作用；泛素化实验显示ATG13以剂量依赖方式增强MAVS K63而非K48/K27/K29多聚泛素化；ASB1敲低或Cullin 5敲低抑制ATG13介导的MAVS K63多聚泛素化；MAVS K348R突变消除ATG13增强的泛素化和报告基因激活。
- 研究意义
- 本研究揭示自噬相关蛋白ATG13在抗病毒天然免疫中的非自噬功能，鉴定其为新型抗IAV宿主限制因子，为理解自噬相关蛋白的非自噬功能提供新视角，并为抗流感治疗开发提供潜在新靶点和理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ATG13对RNA病毒介导的I型干扰素通路的调控
明确ATG13是否特异性增强RNA病毒而非DNA病毒诱导的干扰素通路。
HEK-293T或THP-1细胞转染IFN-β-Luc、ISRE-Luc及ATG13质粒，SeV或ISD刺激或HSV-1感染后检测报告基因活性及IFNB1、CXCL10、IFIT1、OASL转录；ELISA检测IFN-β和TNF-α分泌；Western blot检测IRF3磷酸化。
定位ATG13在RIG-I信号通路中的作用位点并验证与MAVS/TRAF3的相互作用
确定ATG13作用于RIG-I通路的哪个环节及其相互作用靶点。
HEK-293T细胞共转染RIG-I N、MAVS、TBK1、IKKϵ、IRF3-5D及报告基因，检测IFN-β和ISRE活性；Co-IP和共聚焦显微镜检测ATG13与MAVS、TRAF3、RIG-I等的相互作用和共定位。
检测ATG13对MAVS和TRAF3多聚泛素化的影响
明确ATG13是否特异性增强MAVS的K63连接多聚泛素化。
HEK-293T细胞共转染Flag-MAVS或Flag-TRAF3、HA-泛素WT/K63/K48/K27/K29及递增剂量Myc-ATG13，Co-IP检测多聚泛素化；内源性MAVS K63泛素化在ATG13过表达或敲低细胞中检测；SDD-AGE检测MAVS寡聚化。
鉴定ASB1作为ATG13介导MAVS K63泛素化的E3连接酶
确定介导ATG13增强MAVS K63多聚泛素化的E3泛素连接酶及其依赖性。
Co-IP筛选ASB家族成员与ATG13的结合；报告基因定位ASB1在RIG-I通路中的作用位点；Co-IP检测ASB1与MAVS相互作用；剂量递增ASB1检测MAVS K63泛素化；ASB1 shRNA敲低后检测ATG13介导的MAVS K63泛素化及IAV滴度；Cullin 5 siRNA敲低检测CRL5依赖性。
确定ATG13非自噬功能的关键结构域
明确ATG13与MAVS相互作用及其增强干扰素通路的关键结构域，并验证非自噬依赖性。
构建ATG13截短突变体（FL、ΔC、ΔN）及PLBDmut、HDmut，Co-IP和共聚焦检测与MAVS相互作用及共定位；双荧光素酶检测IFN-β和ISRE活性及MAVS K63泛素化；3-MA处理及MAVS与LC3共定位验证非自噬依赖性。
鉴定MAVS与ATG13相互作用及泛素化修饰的关键区域和位点
确定MAVS与ATG13结合的关键区域及ATG13介导泛素化的关键赖氨酸位点。
构建MAVS截短突变体（aa 1–540、1–180、180–540、100–540、360–540、1–360），Co-IP和共聚焦检测与ATG13相互作用及线粒体定位（TOM20）；构建MAVS K297R和K348R点突变，Co-IP检测K63泛素化；在MAVS-/- HEK-293T细胞中回补WT、K297R或K348R并检测IFN-β和ISRE报告基因活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol总RNA提取试剂 | Takara | 9108 |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | M1705 | |
| ChamQ Blue通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312 | |
| Applied Biosystems 7500实时PCR仪 | Applied Biosystems | 7500 | |
| Western blot | HRP偶联抗HA抗体 | Roche | 12013819001 |
| HRP偶联抗Myc抗体 | Roche | 11814150001 | |
| 单克隆抗FLAG M2-过氧化物酶（HRP）小鼠抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| c-MYC多克隆抗体 | Proteintech | 10828-1-AP | |
| HA标签单克隆抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| DYKDDDDK标签多克隆抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| GFP标签单克隆抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| TRAF3多克隆抗体 | Proteintech | 18099-1-AP | |
| ATG13多克隆抗体 | Proteintech | 18258-1-AP | |
| ASB1多克隆抗体 | Proteintech | 16095-1-AP | |
| Cullin 5多克隆抗体 | Proteintech | 31183-1-AP | |
| 免疫荧光 | Multi-rAb CoraLite Plus 594山羊抗小鼠重组二抗（H+L） | Proteintech | RGAM004 |
| Western blot | 兔抗MAVS/VISA抗体 | BETHYL | A300-782A |
| K63连接特异性多聚泛素兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | D7A11 | |
| 磷酸化IRF3（Ser386）兔单克隆抗体 | Beyotime | AF1594 | |
| IRF3兔单克隆抗体 | Beyotime | AF2485 | |
| β-actin小鼠单克隆抗体 | Beyotime | AF0003 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG（H+L） | Beyotime | A0216 | |
| 免疫荧光 | AF488标记山羊抗兔IgG（H+L） | -- | -- |
| TOM20兔单克隆抗体 | Abclonal | A19403 | |
| 自噬抑制 | 3-甲基腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | M9281 |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | C1002 |
| 免疫共沉淀 | Protein A + G琼脂糖 | Beyotime | P2055 |
| NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0398 |
| SDD-AGE | 线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3602 |
| ELISA | 人TNF-α ELISA检测试剂盒 | Proteintech | KE00154 |
| 人IFN-β ELISA检测试剂盒 | Proteintech | KE00195 | |
| 质粒转染 | Lipomaster 3000转染试剂 | Vazyme | TL301 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒复制检测 | H9N2-IAV和H1N1-IAV感染MOI（0.1或1）及感染时间（12–36 h）；TCID50在MDCK细胞中测定，三次重复，Reed–Muench法计算 阅读提示：Methods中Viral infection and virus titration小节，以及Figure 1图注 |
| 干扰素通路报告基因检测 | IFN-β-Luc和ISRE-Luc用量（100 ng）、pRL-TK内参（50 ng）、ATG13质粒用量（100 ng/500 ng/1 μg）、SeV MOI=0.1 12 h或ISD 500 ng/2 μg转染24 h 阅读提示：Methods中Dual luciferase reporter assays小节及Figure 2图注 |
| 泛素化分析 | HA-泛素变体类型（WT、K63、K48、K27、K29），Flag-MAVS或Flag-TRAF3用量，Myc-ATG13递增梯度，IAV感染条件（MOI=0.1，12 h） 阅读提示：Figure 4及Figure 5G–L图注，Co-immunoprecipitation and immunoblotting analysis小节 |
| 非自噬依赖性验证 | 3-MA工作浓度10 mM、处理时间6 h（转染后20 h加入）；PLBDmut和HDmut突变体；MAVS与LC3共定位检测 阅读提示：Figure 6G、6H图注及Results中对应段落 |
| 关键位点突变验证 | MAVS K348R和K297R点突变；MAVS-/- HEK-293T细胞回补WT、K297R或K348R后ATG13对IFN-β和ISRE报告基因活性的影响 阅读提示：Figure 8B、8C图注及Results中The lysine residue at position 348 of MAVS is key for its functional activity小节 |