尸检样本采集与处理
获取阑尾和肠系膜淋巴结组织用于病毒学和病理学分析
在赞比亚大学教学医院，于死亡后48小时内采集17人的阑尾和肠系膜淋巴结组织，进行冻存或制备FFPE块。
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C亚型HIV-1感染的无病毒血症者阑尾组织储存库中的细胞嗜性与病毒遗传学
Cellular Tropism and Viral Genetics in Appendix Tissue Reservoirs of Subtype C HIV-1-Infected Aviremic Persons
实验完整度
中包含尸检组织SGA测序、IHC、IF和RNAscope ISH等验证，但缺乏功能验证和体外感染实验。
主要模型
C亚型HIV-1感染者尸检阑尾组织 同一感染者肠系膜淋巴结组织 HIV阴性对照者阑尾组织
重点核对
队列组成：14例无病毒血症者、2例病毒血症者（P088、P049）和1例HIV阴性对照（P070） SGA阳性率：约22%–30%的第二轮巢式PCR阳性率 RNAscope RNase处理：30分钟以去除RNA，仅保留DNA信号 抗体稀释比例：HIV-1 p24 1:50；CD4 1:50；CD3 1:200；CD21 1:5000；CD68 1:5000 DAPI浓度：300 nmol/L
摘要
背景：尽管抗逆转录病毒治疗（ART）可以抑制HIV感染者的血浆病毒载量，但无法清除持续存在于各种组织储存库中的HIV-1前病毒，停止ART后HIV-1会反弹。我们已经确定阑尾是一个新的HIV组织储存库，但对该组织中的前病毒和细胞嗜性一无所知。方法：我们使用HIV-1 env DNA的单基因组分析，比较了同一HIV-1感染者阑尾组织和淋巴结中的病毒序列。对福尔马林固定、石蜡包埋的阑尾切片进行顺序多重免疫荧光标记和RNAscope原位杂交，通过可视化病毒和细胞生物标志物的共定位，鉴定阑尾中携带HIV-1前病毒DNA的细胞类型。结果：在无病毒血症个体中，阑尾的病毒群体比淋巴结的病毒群体异质性更低，提示存在降低的ART选择压力或存在阑尾嗜性HIV-1。此外，我们证明阑尾内滤泡树突状细胞（FDC）而非CD4+ T细胞是携带C亚型HIV-1的主要细胞类型。值得注意的是，尽管在无病毒血症个体中，一些C亚型HIV-1信号可能是FDC捕获的残留病毒颗粒，但在无病毒血症个体的阑尾组织中，部分FDC中检测到了HIV-1前病毒DNA，表明存在感染的FDC。结论：这些结果强调了分析不同HIV-1亚型的所有潜在组织和细胞嗜性的重要性，以便为可能因亚型而异的多样化储存库制定量身定制的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C亚型HIV-1在无病毒血症者阑尾组织中的前病毒遗传特征和细胞嗜性是什么？
- 核心机制
- 阑尾滤泡树突状细胞（FDC）可被C亚型HIV-1感染并携带前病毒DNA，是阑尾中主要的HIV-1携带细胞类型；阑尾病毒基因组异质性低于淋巴结，提示存在阑尾嗜性病毒或降低的选择压力。
- 主要证据
- 对14例无病毒血症者和2例病毒血症者的阑尾及淋巴结进行HIV-1 env SGA和系统发育分析，显示阑尾序列异质性更低；IHC和多重IF显示p24主要与CD21+ FDC共定位；RNAscope联合RNase处理在CD35+/CD21+ FDC中检测到HIV-1前病毒DNA。
- 研究意义
- 强调需分析不同HIV-1亚型的所有潜在组织和细胞嗜性，以指导针对多样化储存库的定制治疗策略，并提示在C亚型流行地区需采取区域特异性策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HIV-1 env序列扩增与遗传分析
比较阑尾和淋巴结中HIV-1 env序列的异质性和系统发育关系
对阑尾和淋巴结DNA进行巢式PCR扩增env v1–v5，进行bulk测序和SGA，构建系统发育树。
组织学与病毒抗原检测
评估阑尾组织病理变化并鉴定携带HIV-1抗原的细胞类型
对FFPE阑尾切片进行HE染色、IHC和多重IF标记，检测p24及CD4、CD3、CD21、CD68等细胞标志物。
前病毒DNA原位检测与细胞定位
确定FDC是否携带HIV-1前病毒DNA
对FFPE阑尾切片进行RNAscope ISH（C亚型反义探针）联合RNase处理，随后顺序多重IF标记CD4、CD3、CD21、CD35。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | HIV-1 p24抗体 | Invitrogen | -- |
| CD4抗体 | Bio-Techne | -- | |
| CD3抗体 | Abcam | -- | |
| CD21抗体 | Abcam | -- | |
| CD68抗体 | Abcam | -- | |
| 免疫荧光 | Bloxall封闭试剂 | Vector Labs | -- |
| Invitrogen二抗 | Invitrogen | -- | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| RNAscope原位杂交 | RNAscope多重荧光V2检测试剂盒 | ACD Bio | -- |
| Opal 620染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| RNase试剂 | ACD Bio | -- | |
| 免疫荧光 | CD35抗体 | Abcam | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 尸检样本采集 | 样本来源：赞比亚大学教学医院；死亡后采集时间<48小时；样本量：17人；保存方式：-80°C或FFPE 阅读提示：Methods中Study Sample Collection小节 |
| 巢式PCR与SGA | 第一轮PCR模板量100 ng；第二轮模板量2 μL；SGA阳性率约22%–30%；引物序列 阅读提示：Methods中Nested Polymerase Chain Reaction和SGA小节 |
| 免疫组织化学与免疫荧光 | 抗体稀释比例：p24 1:50；CD4 1:50；CD3 1:200；CD21 1:5000；CD68 1:5000；一抗孵育4°C过夜；DAPI浓度300 nmol/L 阅读提示：Methods中Immunohistochemistry和Triple Immunofluorescence Labeling小节 |
| RNAscope原位杂交 | RNase处理30分钟；探针：HIV-1 Clade-C antisense probe；阳性对照PPIB mRNA探针；阴性对照HIV阴性阑尾组织 阅读提示：Methods中RNAscope In Situ Hybridization小节 |
| 队列特征 | 14例无病毒血症者、2例病毒血症者（P088、P049）和1例HIV阴性对照（P070）；血浆病毒载量、ART持续时间、LTR DNA拷贝数 阅读提示：Results中Study Cohort小节及Table 1 |