发现队列纳入与样本蛋白质组检测
建立可纵向追踪的临床转化者、症状前携带者、临床显性ALS患者和对照队列，并获得血浆蛋白质组数据。
纳入Pre-fALS、CRiALS Biomarker和CReATe PGB1研究的参与者，采集血浆并使用Olink Explore HT进行蛋白质组学检测；516份血浆样本来自137名参与者。
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纵向血浆蛋白质组学预测向临床显性ALS的临床转化
Longitudinal plasma proteomics predict phenoconversion to clinically manifest ALS
实验完整度
高包含纵向血浆蛋白质组学、症状前携带者与临床转化者队列及UK Biobank重复，并有时间到事件、预测与时间估计验证。
主要模型
33例发生ALS/FTD临床转化的Pre-fALS参与者血浆样本 35例临床显性ALS患者血浆样本 10例尚未转化的症状前致病性变异携带者血浆样本 59例健康对照血浆样本
重点核对
发现队列纳入516份血浆样本，来自137名参与者；各组分别为33例临床转化者（202次访视）、35例临床显性ALS（126次访视）、10例症状前携带者（62次访视）和59例对照（126次访视） Olink Explore HT panel包含5,440种蛋白质，质控后保留5,298种蛋白质；每份血浆40 µl，516份样本运行于6块板，每块86份样本 临床转化事件预测按访视水平注释为case或control，评估0.5、1、2、3和5年时间范围，并采用五折交叉验证 时间到临床转化分析使用基线蛋白相对丰度、Cox比例风险模型并校正年龄、性别和基因型；LASSO风险评分按中位数分组进行Kaplan–Meier分析 UK Biobank重复队列包括35,722例健康对照、38例症状前携带者、231例临床转化者、33例住院前个体和22例临床显性ALS；使用Olink Explore 3072，包含2,925种蛋白质
摘要
对症状前肌萎缩侧索硬化（ALS）的研究以及疾病预防试验的设计，在很大程度上受限于我们无法预测哪些未发病的ALS相关致病性变异携带者会发生向临床显性疾病的临床转化以及何时发生。在这项纵向Olink Explore高通量蛋白质组学研究中，纳入了来自33例临床转化者、35例ALS患者、10例症状前致病性变异携带者和59例对照的516份连续采集血浆样本。我们鉴定出92种在临床转化前浓度发生变化的蛋白质；刻画了这些蛋白质的纵向轨迹，并鉴定出一个由19种蛋白质组成的核心组合，该组合可预测0.5年至5年时间范围内的临床转化（交叉验证曲线下面积0.80–0.89），并以1.6年的平均绝对误差给出临床转化时间估计。这些发现在UK Biobank数据中得到部分重复，证实了若干蛋白质（例如NEFL、EDA2R和CA3）在症状前升高，并且多蛋白组合在估计临床转化时间方面优于单独使用NEFL。这项工作揭示了症状前ALS的生物学。此外，我们基于经验性纵向数据鉴定出一组新的易感性/风险生物标志物，进一步推进了ALS预防的最终目标。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 未发病的ALS相关致病性变异携带者中，哪些人会发生向临床显性ALS的临床转化以及何时发生，能否通过纵向血浆蛋白质组学进行预测。
- 核心机制
- 症状前ALS阶段存在多种血浆蛋白的相对丰度变化，涉及骨骼肌、细胞外基质、神经丝和再生以及TNF介导信号正调控等生物学通路；NEFL反映轴突丢失，而多蛋白组合可反映更广泛的症状前病理生物学过程。
- 主要证据
- 在516份连续血浆样本的Olink Explore HT蛋白质组学分析中，鉴定出92种在临床转化前变化的蛋白质和19蛋白核心组合；该组合预测0.5–5年临床转化的交叉验证AUC为0.80–0.89，估计临床转化时间的平均绝对误差为1.6年，并在UK Biobank中部分重复。
- 研究意义
- 研究揭示了症状前ALS的生物学，并基于经验性纵向数据鉴定出一组新的易感性/风险生物标志物，可用于未来ALS预防试验中富集短期高风险人群，推进ALS预防的最终目标。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
疾病状态差异蛋白鉴定
筛选在临床显性ALS与健康对照间差异表达的蛋白质，作为下游候选。
使用混合效应模型比较临床显性ALS与健康对照的Olink Explore HT蛋白数据，并进行GO富集和蛋白互作网络分析。
症状前蛋白纵向轨迹建模
评估临床显性ALS与对照间差异蛋白是否在临床转化前已发生变化，并确定变化起始时间。
使用两层GAMM框架对差异蛋白的纵向轨迹建模，纳入临床转化者和临床显性ALS数据；临床显性ALS以报告无力发生时间作为临床转化替代。
时间到临床转化 Cox 建模
评估基线蛋白生物标志物与后续临床转化风险之间的关联。
对临床转化者和症状前个体使用Cox比例风险模型分析基线蛋白相对丰度；并进行LASSO惩罚多变量Cox建模和Kaplan–Meier分析。
临床转化事件预测模型
预测症状前致病性变异携带者在特定时间范围内是否发生临床转化。
使用137种差异蛋白，在访视水平注释case/control，评估七种机器学习方法；最终采用五折交叉验证的逻辑回归并逐步选择蛋白。
临床转化时间估计模型
估计临床转化者距离临床转化的时间。
使用截断回归模型，仅纳入临床转化者转化前访视数据，以最终蛋白组合作为输入特征，并估计年到临床转化时间。
UK Biobank 重复分析
在独立队列中定性验证发现队列的蛋白质变化和临床转化时间估计表现。
使用UKB-PPP的Olink Explore 3072数据，定义健康对照、症状前、临床转化者、住院前和临床显性ALS组；对重叠蛋白进行差异表达、伪纵向轨迹和截断回归分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血浆蛋白质组检测 | Olink Explore HT | Olink | -- |
| Olink Explore 3072 | Olink | -- | |
| Olink文库纯化 | Agencourt AMPure XP磁珠 | -- | -- |
| Olink文库质量评估 | Agilent TapeStation系统 | Agilent | -- |
| Olink文库测序 | S4流动池 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- | |
| 血浆采集 | K2 EDTA管 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 发现队列样本与分组 | 样本量、组别和访视数：临床转化者33例（转化前33例、转化后23例，共202次访视）、临床显性ALS 35例（126次访视）、症状前携带者10例（62次访视）、对照59例（126次访视）；总样本516份，来自137名参与者。 阅读提示：Methods 'Experimental design: participant and sample selection and Olink plate assignment' 及 Table 1、Extended Data Fig. 1。 |
| Olink 蛋白质组检测与质控 | Olink Explore HT panel起始5,440种蛋白质，质控后保留5,298种；每份血浆40 µl；516份样本运行于6块板，每块86份样本；同一参与者纵向样本在同一板。 阅读提示：Methods 'Proximity extension assay, library preparation and next-generation sequencing'、'Normalizing protein expression'、'Additional QC procedures'。 |
| 疾病状态差异蛋白分析 | 比较临床显性ALS（n=35，126次访视）与健康对照（n=59，126次访视）；混合效应模型校正年龄、性别、基因型组；FDR=0.05；鉴定137种差异蛋白。 阅读提示：Methods 'Step 1. Differentially expressed protein selection' 及 Fig. 1、Supplementary Table 1。 |
| 临床转化事件预测建模 | 使用137种差异蛋白；时间范围0.5、1、2、3、5年；访视水平注释case/control；逻辑回归加五折交叉验证；蛋白组合分别为20、11、24、34、25种蛋白；Youden指数确定阈值。 阅读提示：Methods 'Step 4. Phenoconversion event prediction'、Extended Data Table 2、Extended Data Table 3、Extended Data Table 4 及 Fig. 4。 |
| 临床转化时间估计与关键条件 | 使用截断回归，仅纳入临床转化者转化前访视；校正年龄、性别和基因型组；19蛋白组合cor=0.79、MAE=1.62年；NEFL单独cor=0.48、MAE=2.37年。 阅读提示：Methods 'Step 5. Phenoconversion timing estimation'、Fig. 4d 及 Extended Data Table 1。 |
| UK Biobank 重复分析 | UKB-PPP使用Olink Explore 3072，包含2,925种蛋白质；纳入健康对照35,722、症状前38、临床转化者231、住院前33、临床显性ALS 22；临床转化时间近似为G12.2住院前2年；使用横断面数据构建两层GAM。 阅读提示：Methods 'UKB replication'、Table 1、Extended Data Fig. 5、Fig. 5 及 Extended Data Table 5。 |