构建DLPFC来源的微蛋白搜索数据库
将未注释smORF编码序列纳入质谱搜索空间，以发现经典蛋白质组数据库遗漏的微蛋白
对12份DLPFC样本进行Oxford Nanopore长读长RNA-seq，使用ESPRESSO组装转录本，三框翻译后追加至UniProt参考蛋白质组UP000005640，得到2,174,307个候选ORF
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阿尔茨海默病人额叶皮质的微蛋白图谱
A microprotein atlas of the human frontal cortex in Alzheimer's disease
实验完整度
高包含死后脑组织多组学、Ribo-seq、TMT-MS、细胞系KO/过表达及线粒体功能验证
主要模型
ROSMAP和MSBB死后人DLPFC样本 人HMC3小胶质细胞系 micro-MKKS63 CRISPR-Cas9敲除HMC3多克隆细胞系 ACTBP7-psORF过表达HMC3细胞
重点核对
ROSMAP TMT-MS队列：610份DLPFC样本经蛋白组学流程，608份通过质控，480份用于差异肽分析 差异丰度模型： stringent模型要求至少50%样本检测到，relaxed模型使用所有定量蛋白；高置信FDR<0.05，探索性0.05≤FDR<0.2 micro-MKKS63 KO：两条独立sgRNA多克隆HMC3细胞系，Seahorse XF Mito Stress Test检测OCR，oligomycin 2μM、CCCP 3μM、rotenone/antimycin A各1μM PROSIT谱图分级：基于SA评分和碎片离子覆盖，将未审阅MP分为strong/moderate/weak/insufficient四档，并与两名独立人工评审交叉验证 细胞过表达定位：HMC3中转染C端FLAG或ALFA标签构建体，24h后免疫细胞化学检测
摘要
理解神经退化的分子基础需要一份基因组蛋白编码产物的全面图谱。尽管人类大脑中翻译了数千个小开放阅读框（ORF），但支持其编码的微蛋白（MPs）（≤150个氨基酸（aa））的蛋白质组学证据仍然有限。在此，我们展示了一份大脑MP图谱，该图谱整合了转录组学、质谱分析和深度学习预测谱图，覆盖了600多份有或无阿尔茨海默病（AD）的死后额叶皮质样本。我们鉴定出1,067个未收录于已审阅UniProtKB条目中的MPs，并具有高置信度谱图支持。其中一部分在AD中差异表达，且独立于同一基因座上注释的主ORF。MKKS表达的一个小ORF编码一个63个氨基酸的MP，是该基因座的主要翻译产物，并在AD中下调；其缺失会损害小胶质细胞线粒体呼吸，提示其参与小胶质细胞生物能量学。该图谱扩展了已注释的大脑蛋白质组，并为研究衰老和神经退化中的MPs提供了资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 构建衰老和阿尔茨海默病人额叶皮质微蛋白图谱，鉴定未注释微蛋白并探究其在AD中的表达变化和功能。
- 核心机制
- MKKS基因座的小ORF编码63个氨基酸微蛋白micro-MKKS63，是该基因座主要翻译产物，定位于线粒体，其缺失降低小胶质细胞氧化磷酸化；部分smORF转录本通过转录后剪接和RBP调控与主ORF解偶联。
- 主要证据
- 整合12份DLPFC长读长转录组、610份ROSMAP TMT-MS、43份Ribo-seq和PROSIT深度学习谱图分级，鉴定1,067个强等级未审阅MP；micro-MKKS63在HMC3中内源表达，过表达定位于线粒体，CRISPR-Cas9敲除降低基础OCR、ATP关联OCR和最大呼吸。
- 研究意义
- 扩展了已注释的大脑蛋白质组，提供研究衰老和神经退化中微蛋白的资源；提示基于经典注释的功能研究可能靶向低丰度或疾病相关性较低的蛋白。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TMT-MS鉴定脑内微蛋白
在有和无AD的老年DLPFC样本中鉴定具有独特质谱证据的微蛋白
使用FragPipe、Philosopher和IonQuant搜索610份ROSMAP DLPFC样本的TMT-MS数据，获得4,321个通过蛋白鉴定的MPs，包括3,217个未审阅和1,104个已审阅MPs
PROSIT深度学习谱图分级
评估未审阅微蛋白的质谱谱图质量，区分可靠鉴定与不可靠鉴定
对3,001个可进行PROSIT分析的未审阅MPs，比较观测谱图与Prosit_2020_intensity_TMT模型预测谱图，根据SA评分和碎片离子覆盖分配strong/moderate/weak/insufficient等级
Ribo-seq和ShortStop整合验证翻译
为MS未检测到的微蛋白提供正交翻译证据，并评估其编码潜力
重新分析43份非AD DLPFC的Ribo-seq数据，使用Rp3框架进行核糖体足迹定量，并用ShortStop机器学习分类器评估smORF编码微蛋白的可能性
AD中微蛋白差异丰度和RNA差异表达分析
鉴定在AD中差异表达的微蛋白及其与主ORF的表达解偶联
对480份ROSMAP DLPFC TMT-MS样本进行差异丰度分析（非AD vs 症状性AD），同时对373份匹配RNA-seq样本进行DESeq2差异表达分析，并在MSBB队列中复制
micro-MKKS63线粒体定位和功能验证
验证micro-MKKS63的线粒体定位及其对小胶质细胞氧化磷酸化的功能必要性
在HMC3细胞中过表达C端FLAG标签的micro-MKKS63，免疫荧光共染IMMT；使用两条sgRNA生成CRISPR-Cas9敲除多克隆细胞系，Seahorse Mito Stress Test检测OCR
假基因来源微蛋白的正交证据验证
测试核糖体足迹、ShortStop预测和独特胰蛋白酶肽检测能否共同支持假基因位点微蛋白鉴定
对ACTBP7假基因位点，分析43份非AD DLPFC Ribo-seq覆盖，鉴定两个独特胰蛋白酶肽并获中等PROSIT等级；在HMC3中过表达ACTBP7-psORF，检测F-actin分布
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建微蛋白搜索数据库
验证免疫效应和细胞定位
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和转染 | HMC3人小胶质细胞 | ATCC | CRL-3304 |
| 细胞转染 | Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫细胞化学 | 小鼠抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 兔抗Mitofilin抗体 | Proteintech | 10179-1-AP | |
| 兔抗ALFA多克隆抗体 | NanoTag | N1581 | |
| FluoTag-X2抗ALFA 568 | NanoTag | N1502 | |
| 鬼笔环肽 | Invitrogen | -- | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | |
| 抗兔Alexa Fluor 594 | Jackson ImmunoResearch | 111-585-003 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Ibidi抗淬灭封片剂 | Ibidi | 50011 | |
| 共聚焦成像 | Nikon A1R共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| DIA-MS | PRTC标准品 | Pierce | 88320 |
| EASY-Spray PepMap Neo色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | ES75150PN | |
| Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18柱Nest Group BioPureSPN Mini | Nest Group | HUM S18V | |
| HMC3细胞酸提取和LC-MS/MS | BondElut C8固相萃取柱 | Agilent Technologies | -- |
| 测序级胰蛋白酶 | Promega Corporation | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CRISPR-Cas9慢病毒生产 | pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 |
| pMDLg/pRRE质粒 | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev质粒 | Addgene | 12253 | |
| lentiGuide-Puro质粒 | Addgene | 52963 | |
| lentiCas9-Blast质粒 | Addgene | 52962 | |
| PEI-Max转染试剂 | Polysciences | 24765 | |
| HEK 293FT细胞 | Invitrogen | R70007 | |
| Seahorse线粒体压力测试 | XF线粒体压力测试试剂盒 | Seahorse | -- |
| Seahorse XF96分析仪 | Seahorse | -- | |
| 组织匀浆 | Precellys Cryolys Evolution匀浆器 | Bertin Technologies | -- |
| Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TMT-MS微蛋白鉴定 | 样本数、批次、组分、FDR阈值、前体和碎片质量容差、消化条件 阅读提示：Methods "TMT-based proteomics and protein identification analysis"；Fig. 1a图注 |
| PROSIT谱图分级 | SA阈值、碎片离子覆盖分级标准、NCE、候选PSM过滤条件 阅读提示：Methods "Spectral validation of MP PSMs using PROSIT"；Fig. 2a,b |
| AD差异丰度和差异表达分析 | 诊断分组标准、样本量、检测率阈值、FDR分层、协变量调整模型 阅读提示：Methods "Normalization, covariate adjustment and differential expression analysis of TMT proteomics data"；Fig. 3a,b图注 |
| micro-MKKS63 CRISPR敲除和线粒体功能 | sgRNA序列、细胞系、sgRNA数量、Seahorse抑制剂浓度、重复数和归一化方式 阅读提示：Methods "CRISPR–Cas9 editing of micro-MKKS63 and mitochondrial stress testing"；Fig. 7g–k |
| 细胞过表达和免疫荧光定位 | 构建体标签、转染条件、抗体稀释比例、转染后时间、独立转染次数 阅读提示：Methods "Cell culture, transient transfection and immunocytochemistry"；Fig. 7a–e |