PMOS患者循环多胺及生化指标检测
确定PMOS患者循环多胺水平及其与生化指标的关系。
采集PMOS患者和健康对照全血,HPLC检测腐胺、亚精胺、精胺,并检测BMI、餐后胰岛素、餐后血糖、睾酮和雌二醇。
Reduced circulating polyamines in polyendocrine metabolic ovarian syndrome patients and the impact of putrescine on ovarian function and fertility in a murine PMOS model†
含PMOS患者血液样本HPLC检测及DHEA诱导小鼠模型,涵盖激素、基因、蛋白、组织形态和妊娠功能验证。
PMOS患者全血样本(n=30/组) DHEA诱导的青春期前雌性Balb/c小鼠PMOS样模型 PUT1处理的PMOS样小鼠妊娠模型
PMOS患者与对照组各30例,全血多胺经HPLC检测。 小鼠DHEA皮下注射6 mg/100 g体重/天,溶于0.01 mL 95%乙醇+0.09 mL芝麻油,连续25天。 PUT1剂量150 μg/250 g体重/天,PUT2 250 μg/250 g体重/天,AGM 250 μg/250 g体重/天,DFMO 100 mg/kg体重/天,均处理5天。 Phase II中PUT1处理后合笼,以阴道栓确认妊娠第1天,妊娠10天后处死取子宫。 卵巢和子宫基因表达以β-actin为内参,采用2^-ΔΔCT法,qPCR每样本三重复。
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定PMOS患者循环多胺水平及其与生化指标的关系。
采集PMOS患者和健康对照全血,HPLC检测腐胺、亚精胺、精胺,并检测BMI、餐后胰岛素、餐后血糖、睾酮和雌二醇。
建立具有高体重、高血糖和高雄激素特征的PMOS样小鼠模型。
22日龄青春期前雌性Balb/c小鼠皮下注射DHEA 25天,对照注射溶剂。
比较不同多胺和DFMO对PMOS样小鼠表型的影响。
DHEA处理后,分别给予PUT1、PUT2、AGM和DFMO 5天。
评估多胺处理对PMOS样小鼠代谢和内分泌指标的改善。
每5天测体重,处理结束后测空腹血糖,ELISA检测血清GnRH、GnIH和睾酮。
评估多胺处理对卵巢卵泡和子宫形态的改善。
H&E染色卵巢和子宫切片,计数健康/闭锁卵泡和囊肿,测量子宫肌层、内膜和腔上皮厚度。
探究多胺处理对GnRH系统、炎症、卵泡发生和子宫容受性相关基因表达的影响。
提取右卵巢、子宫和下丘脑RNA,RT-qPCR检测相关基因表达。
验证FSHR、CYP19A1、ADIPOQ、ODC1、SMS、SRM、ESRα、ESRβ和PGR在卵巢和子宫中的表达变化。
免疫组化和免疫荧光检测蛋白表达,ImageJ定量。
验证PUT1能否促进PMOS样小鼠成功妊娠。
PUT1处理后合笼,阴道栓确认妊娠,妊娠10天后处死取子宫观察着床。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 临床生化分析 | 总睾酮试剂盒 | Roche | 07027915190 |
| 餐后胰岛素试剂盒 | Roche | 07027559190 | |
| 雌二醇试剂盒 | Roche | 06656021190 | |
| 餐后血糖试剂盒 | Roche | 04404483190 | |
| HPLC多胺检测 | Shimadzu RF-20A荧光检测器 | Shimadzu | -- |
| 多胺处理 | 腐胺 | Sigma-Aldrich | P5780-5G |
| 胍丁胺 | Sigma-Aldrich | A7127-1G | |
| DFMO | Tokyo Chemical Industry Co. LTD. | D0044 | |
| PMOS诱导 | 脱氢表雄酮 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | D0044 |
| 血糖检测 | 血糖仪 | Gluco one | A11 |
| ELISA | 小鼠GnRH ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-E08152m |
| 小鼠GnIH ELISA试剂盒 | MyBioSource | MBS9368212 | |
| 小鼠睾酮ELISA试剂盒 | Bioassay Technology Laboratory | E0260Mo | |
| 组织切片 | 切片机 | Leica | RM2125 RTS |
| H&E染色 | 伊红 | Himedia | SO07-125ML |
| 显微镜观察 | 复合光学显微镜 | Leica | DM2000LED |
| 毒性检测 | 碱性磷酸酶试剂盒 | Coral Clinical Systems | 1102020103 |
| SGOT试剂盒 | Coral Clinical Systems | 1102200075 | |
| SGPT试剂盒 | Coral Clinical Systems | 1102210075 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion by Life Technologies | 15596026 |
| DNase I | Thermo Scientific | EN0521 | |
| cDNA合成 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1622 |
| qPCR | Sybr-green 2X PCR预混液 | Bio-Rad | 1725275 |
| AriaMx实时PCR系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 免疫组化 | 芳香化酶(CYP19A1)兔多克隆抗体 | Invitrogen | PA1-16532 |
| 脂联素(ADIPOQ)单克隆抗体 | Invitrogen | 701148 | |
| FSHR单克隆抗体 | Invitrogen | PA5-50963 | |
| 免疫荧光 | ODC1抗体 | Invitrogen | PA5-21362 |
| SMS抗体 | Invitrogen | MA5-44855 | |
| SRM抗体 | Invitrogen | PA5-102895 | |
| ESRα抗体 | Invitrogen | MA1-80216 | |
| ESRβ抗体 | Invitrogen | PA1-311 | |
| PGR抗体 | Invitrogen | MA1-411 | |
| 山羊抗兔IgG Cy3 | Abcam | ab6939 | |
| 山羊抗小鼠IgG FITC | Sigma-Aldrich | F0257 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Olympus Corporation | FV3000 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PMOS患者样本采集 | 样本量n=30/组,年龄18-40岁,空腹8-10小时,采血时间08:00-10:00,EDTA管保存于-80°C。 阅读提示:Methods中Patient recruitment, sample collection, and clinical analysis小节。 |
| DHEA诱导PMOS样小鼠模型 | 小鼠品系Balb/c,22日龄青春期前雌性,DHEA剂量6 mg/100 g体重/天,溶剂0.01 mL 95%乙醇+0.09 mL芝麻油,皮下注射25天,每组n=4。 阅读提示:Methods中Animals and experimental design小节及Figure 2 legend。 |
| 多胺和DFMO处理 | PUT1 150 μg/250 g体重/天,PUT2 250 μg/250 g体重/天,AGM 250 μg/250 g体重/天,DFMO 100 mg/kg体重/天,处理5天。 阅读提示:Methods中Animals and experimental design小节。 |
| 妊娠和着床评估 | PUT1处理后合笼,阴道栓确认妊娠第1天,妊娠10天后处死,每组n=4。 阅读提示:Methods中Animals and experimental design小节及Figure 4G。 |
| 基因表达分析 | TRIzol提取RNA,1 μg RNA用于cDNA合成,qPCR每样本三重复,以β-actin为内参,2^-ΔΔCT法。 阅读提示:Methods中RNA extraction and quantitative real-time PCR小节及Supplementary Table S1。 |