PMRC队列样本采集与CD138+浆细胞富集
获取高纯度多发性骨髓瘤浆细胞用于分子表征。
从2011至2019年（及部分至2023年）在Moffitt Cancer Center采集外周血和骨髓穿刺样本，经Ficoll梯度分离BMMC后使用抗体偶联磁珠富集CD138+细胞，并进行WES和RNA-seq。
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整合基因组与表观基因组分析揭示多发性骨髓瘤疾病进展与多药耐药中的表观遗传可塑性
Integrated Genomic and Epigenomic Analysis Reveals Epigenetic Plasticity in Disease Progression and Multidrug Resistance in Multiple Myeloma
实验完整度
高近900例患者组织样本，体外细胞系功能扰动及等基因耐药模型，结合多组学与功能验证
主要模型
多发性骨髓瘤患者CD138+骨髓穿刺样本（PMRC队列，约900例） 18例CD138+样本的scMultiome单细胞多组学（2例健康供者、3例MGUS、4例SMM、3例NDMM、1例ERMM、5例LRMM） 8226与蛋白酶体抑制剂耐药8226-B25等基因细胞系对 8例患者样本H3K27ac CUT&Tag（4例NDMM、4例LRMM）
重点核对
PMRC队列样本：CD138+富集后平均纯度95.3%（CI 88.1%–100%） WES肿瘤/正常配对测序深度：正常100×、肿瘤300×（440个癌症基因600×） scMultiome样本细胞数：每个样本5,361至11,293个细胞 8226-B25耐药模型：慢性暴露于bortezomib，剂量递增至25 nmol/L YY1敲低：多西环素0.5 µg/mL诱导，120小时检测细胞数量
摘要
多发性骨髓瘤以随着疾病进展而累积的复发性细胞遗传学异常和突变为特征。在本研究中，我们试图利用一个独特的、涵盖从癌前病变到晚期难治性多发性骨髓瘤的近900例患者队列，在分子和临床层面进行全面表征，以阐明驱动多发性骨髓瘤肿瘤发生和治疗耐药的转变过程。表观遗传失调的波浪式变化驱动了这些关键转变。在这一范式中，基因组和细胞遗传学事件解锁了表观遗传可塑性，重塑多发性骨髓瘤细胞生物学，以逃逸肿瘤微环境约束和治疗压力。在等基因蛋白酶体抑制剂耐药细胞系模型中的功能扰动研究显示，其对转录辅因子的依赖性增强，支持染色质可塑性与治疗适应之间的机制联系。总体而言，这些发现支持一个统一框架，即基因组异质性解锁基因调控可塑性，使浆细胞（PC）能够逃逸微环境约束和治疗压力。这些结果为在没有新的基因组改变的情况下发生序贯复发提供了机制解释，并提名表观遗传可塑性介导的PC适应作为多发性骨髓瘤异质性遗传背景下的治疗脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 多发性骨髓瘤从癌前病变到晚期难治性疾病的转变过程以及治疗耐药是如何被驱动的。
- 核心机制
- 基因组和细胞遗传学事件解锁表观遗传可塑性，通过染色质可塑性和H3K27ac格局重塑基因调控，使浆细胞逃逸肿瘤微环境约束和治疗压力；LRMM中H3K27ac信号及转录机器/辅因子表达增加驱动增殖、DNA修复和代谢程序。
- 主要证据
- 近900例PMRC队列的WES、RNA-seq和临床数据；18例样本scMultiome显示MGUS到SMM转变伴随染色质可及性变化；8例NDMM/LRMM样本H3K27ac CUT&Tag显示LRMM中H3K27ac信号升高；8226-B25耐药细胞系中YY1敲低降低细胞数量并对多种药物产生叠加效应。
- 研究意义
- 提出表观遗传可塑性作为多发性骨髓瘤进展和多药耐药的潜在可干预脆弱性，可能为阻止前驱疾病进展和克服多药耐药提供治疗窗口。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全外显子测序和突变分析
识别驱动多发性骨髓瘤进展和耐药的遗传事件。
对CD138+富集样本进行WES，使用Sentieon、TNhaplotyper2和Funcotator进行变异检测和注释，应用PoN过滤和位置多样性QC。
批量转录组测序和差异表达分析
识别跨疾病阶段的转录组变化和预后特征。
对CD138+富集样本进行RNA-seq，计算FPKM和TPM，进行差异表达分析、GSEA、ssGSEA和PCA，并基于癌症标志物定义PC1转录状态。
单细胞多组学分析
在单细胞水平验证染色质可及性与基因表达在疾病进展中的变化。
对18例CD138+骨髓穿刺样本进行scMultiome（paired scRNA-seq/scATAC-seq），分析细胞聚类、染色质可及性、基因表达、拟时序和拷贝数变异。
H3K27ac CUT&Tag和超级增强子分析
检测H3K27ac修饰和超级增强子活性在NDMM与LRMM之间的差异。
对4例NDMM和4例LRMM的CD138+纯化原代细胞进行H3K27ac CUT&Tag，使用ROSE鉴定超级增强子，分析增强子相关基因表达。
体外耐药细胞系功能扰动
验证转录辅因子在蛋白酶体抑制剂耐药中的作用。
使用8226和8226-B25等基因细胞系，进行YY1敲低、Western blot、细胞数量检测和高通量体外药物筛选。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 8226细胞 | ATCC | CCL-155 |
| HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| 药物处理 | 硼替佐米 | -- | -- |
| 卡非佐米 | -- | -- | |
| 帕比司他 | -- | -- | |
| 美法仑 | -- | -- | |
| 达雷妥尤单抗 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| JQ1 | -- | -- | |
| 他泽司他 | -- | -- | |
| mezigdomide | -- | -- | |
| 维奈克拉 | -- | -- | |
| C646 | -- | -- | |
| 泊马度胺 | -- | -- | |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| 遗传霉素 | InvivoGen | ant-gn-5 | |
| CD138+细胞分离 | CD138磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-051-301 |
| 单细胞多组学 | 洋地黄皂苷 | Invitrogen | BN2006 |
| Flowmi细胞过滤器 | SP Bel-Art | H13680-0040 | |
| H3K27ac CUT&Tag | 抗H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 |
| Western blot | YY1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7341 |
| α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| HRP偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-174 | |
| HRP偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 211-032-171 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| 文库制备 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2101/2 |
| 慢病毒包装 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| MISSION慢病毒包装混合液 | Sigma-Aldrich | SHP001 | |
| 慢病毒感染 | Polybrene转染试剂 | Millipore | TR-1003-G |
| 细胞过滤 | Millex-HA过滤器 | Millipore | SLHAM33SS |
| 支原体检测 | VenorGeM qEP试剂盒 | Minerva Biolabs | -- |
| 细胞计数 | Cellometer Spectrum 5细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | -- |
| 细胞活力检测 | Invitrogen Countess II自动细胞计数仪 | Invitrogen | -- |
| 高内涵成像 | EVOS Auto FL 2显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 药物筛选 | PhenoPlates培养板 | PerkinElmer | -- |
| PureCol胶原 | Advanced BioMatrix | -- | |
| 核酸提取 | QIAsymphony DNA纯化系统 | Qiagen | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500v4测序仪 | Illumina | -- | |
| 单细胞多组学 | 10x Genomics Chromium Controller遗传分析仪 | 10x Genomics | -- |
| 10x Chromium Next GEM Chip J单细胞试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| 10x Genomics Chromium NextGEM单细胞ATAC试剂盒v1.1 | 10x Genomics | -- | |
| WES文库制备 | NimbleGen SeqCap EZ试剂盒 | NimbleGen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集与CD138+细胞富集 | 骨髓穿刺体积20 mL；CD138+富集后平均纯度95.3%（CI 88.1%–100%）；使用抗体偶联磁珠（Miltenyi Biotec, cat. #130-051-301）。 阅读提示：Materials and Methods中"CD138+ cell isolation"小节；Supplementary Table S1/S3。 |
| WES测序深度与QC | 正常覆盖100×，肿瘤覆盖300×，440个癌症基因覆盖600×；>80%碱基>20×覆盖；p95 VAF ≥0.20定义克隆信号。 阅读提示：Materials and Methods中"DNA sequencing"和"Mutation calling: assessment and QC"小节。 |
| RNA-seq差异表达分析参数 | FDR q = 0.01；ssGSEA使用50个癌症标志物；PCA基于CancerHallmarks ssGSEA NES。 阅读提示：Materials and Methods中"Differential gene expression and enrichment analysis"和"Principal component analysis of biological pathways"小节。 |
| scMultiome样本组成与测序深度 | 18例CD138+样本：2例健康供者、3例MGUS、4例SMM、3例NDMM、1例ERMM、5例LRMM；每样本5,361–11,293细胞；ATAC和RNA分别25,000和50,000 reads/cell。 阅读提示：Materials and Methods中"Single-cell paired Assay for Transposase-Accessible Chromatin/RNA-seq"小节；Supplementary Table S12。 |
| H3K27ac CUT&Tag和超级增强子分析 | 4例NDMM和4例LRMM；anti-H3K27ac抗体1.3 µL/反应（Active Motif cat. #39133）；ROSE stitching window 15 kb；测序8 million paired-end reads。 阅读提示：Materials and Methods中"Cleavage Under Targets and Tagmentation assay"和"Superenhancer calling"小节；Supplementary Table S15–S18。 |
| 8226-B25耐药细胞系建立和YY1敲低 | 8226-B25由8226经bortezomib慢性暴露至25 nmol/L建立；YY1敲低使用多西环素0.5 µg/mL诱导；细胞数量检测120小时；药物筛选药物浓度范围（bortezomib等50 nmol/L，melphalan 50 µmol/L等）。 阅读提示：Materials and Methods中"Generation of the proteasome inhibitor–resistant 8226-B25 cell line"、"Gene knockdown"和"High-throughput in vitro drug screening assay"小节；Figure 6Q–6S。 |