血浆样本制备与PMPs生成
获取库存血浆和新鲜血小板来源的PMPs用于后续分离和比较
外周血收集于10 ml EDTA管，1,500 × g离心30分钟分离血浆，-80°C保存；新鲜富血小板血浆（PRP）通过280 × g离心10分钟制备；血库过期血小板用大鼠胶原Type 1处理20小时生成PMPs。
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应用基于流式细胞术的血小板衍生微粒分离技术处理库存人血浆用于细胞研究
Applying flow cytometry-based isolation of platelet-derived microparticles to banked human plasma for cellular studies
实验完整度
高包含流式分选、电镜、NTA及HUVEC/THP-1细胞摄取验证，涉及体外模型和功能验证
主要模型
库存冷冻保存人血浆 新鲜血小板生成PMPs 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） THP-1细胞
重点核对
PMPs通过流式细胞术检测CD41阳性及180–1,300 nm尺寸校准微球确定，纯度>98% CD9阳性率95%，ApoB阴性，CD45阳性率0.32%，CD235a阳性率1.44% 0.2% Triton X-100处理30分钟消除CD41+事件 NTA显示大部分颗粒~100–1,000 nm，>800 nm颗粒很少 电镜显示分选PMPs约100–400 nm
摘要
血小板衍生微粒（PMPs）构成血液中循环微粒的多数。PMPs携带包括RNA、蛋白质和miRNA在内的货物，并在心血管、自身免疫和肝脏疾病中发挥关键的病理生理细胞间信号传导作用。大多数方法使用经激动剂处理的新鲜血小板来生成PMPs，这限制了人类研究的规模和可行性。随着大型生物样本库（如英国生物样本库，https://www.ukbiobank.ac.uk/）的兴起，且由于微粒在冷冻保存的血浆中得以保留，本研究旨在开发一种高效且可重复的方法，从库存的冷冻保存人血浆中分离PMPs，以研究其与靶细胞的通讯。我们采用流式细胞术，使用180–1,300 nm尺寸校准微球和血小板特异性标志物CD41，根据大小和CD41阳性来识别并分选PMPs。分离后，通过电子显微镜和纳米颗粒追踪分析验证了微粒的大小和形态。为评估微粒在细胞–细胞相互作用研究中的效用，我们可视化了微粒被人脐静脉内皮细胞和THP‐1细胞摄取的过程。我们的方法能够分离人PMPs并进行细胞–细胞相互作用的下游分析，促进大规模人群和罕见疾病的转化研究。© 2026 大不列颠和爱尔兰病理学会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种高效且可重复的方法，从库存的冷冻保存人血浆中分离血小板衍生微粒（PMPs），并用于研究其与靶细胞的通讯？
- 核心机制
- PMPs携带蛋白质、mRNA和miRNA，介导细胞间通讯；本研究验证了分选的PMPs可被内皮细胞和单核细胞摄取。
- 主要证据
- 通过流式细胞术使用CD41和尺寸校准微球分选PMPs，电镜和NTA验证大小形态，共聚焦显微镜显示PMPs被HUVECs和THP-1细胞内化。
- 研究意义
- 该方法使得从大型生物样本库和罕见疾病中研究PMPs及其细胞间通讯成为可能，促进了大规模人群和罕见疾病的转化研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术染色与分选PMPs
基于CD41阳性和尺寸分选PMPs
血浆或分离的PMPs稀释后加入CD41-AlexaFluor 647或同型对照1:50稀释，室温暗处染色30分钟，PBS稀释至1 ml后上机。使用BigFoot™ Spectral Cell Sorter，100-μm喷嘴，收集于无菌PBS。
PMPs的验证（电镜和NTA）
确认分离的PMPs的大小和形态
分选后PMPs经超速离心或浓缩，进行NTA（ZetaView，488 nm激光）和透射电镜（80 kV FEI Tecnai G2 Biotwin）观察。
PMPs与靶细胞相互作用验证
评估分选的PMPs能否被靶细胞内化
HUVECs和PMA分化的THP-1细胞与CellTracker Red CMTPX标记的PMPs共孵育1小时，固定、透化、染色后共聚焦显微镜观察内化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血浆制备 | EDTA管 | -- | -- |
| PMPs生成 | 大鼠胶原，1型 | Sigma-Aldrich | 08-115 |
| 流式染色 | CD41-AlexaFluor 647抗体 | BioLegend | 303725 |
| 流式分选 | BigFoot™光谱细胞分选仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 聚苯乙烯微球 | Apogee | 1527 | |
| PMPs标记 | CellTracker™ Red CMTPX | Invitrogen | C34552 |
| PMPs浓缩 | Amicon Ultra 15 ml 100 K过滤器 | Amicon | UFC9100 |
| 共聚焦显微镜 | Leica SP8 LIGHTNING共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 电子显微镜 | 电镜载网（200目铜网） | EMS | -- |
| FEI Tecnai G2 Biotwin透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| AMT NanoSprint15 MK-II, Config M相机 | AMT | -- | |
| 纳米颗粒追踪分析 | ZetaView仪器 | Particle Metrix | -- |
| 细胞培养 | PromoCell内皮细胞生长培养基MV2 | PromoCell | C-22022 |
| 人纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | 4078547 | |
| 盖玻片 | CellTreat | 229173 | |
| THP-1细胞 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| 细胞染色 | Alexa Flour 647偶联鬼笔环肽 | Invitrogen | A22287 |
| 含DAPI的Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | F6057-20ML |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆样本制备 | 血液收集管类型（EDTA管）、离心条件（1,500 × g，30分钟）、储存温度（-80°C） 阅读提示：Materials and methods: Human plasma preparation |
| PMPs流式染色与分选 | CD41抗体稀释比例（1:50）、染色时间（30分钟）、分选仪型号和喷嘴尺寸（100-μm） 阅读提示：Materials and methods: Staining of PMPs for flow cytometry; Flow cytometry analysis and sorting |
| PMPs验证 | Triton X-100浓度（0.2%）、处理时间（30分钟）、NTA激光波长（488 nm）、电镜电压（80 kV） 阅读提示：Results and discussion: Flow cytometry validation of PMPs; EM and NTA |
| 细胞摄取实验 | PMPs标记浓度（1 μM CellTracker）、孵育时间（1小时）、细胞类型（HUVECs, THP-1）和分化条件（PMA 48小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture with PMPs; Results and discussion: FACsorted PMPs in downstream experiments |