WPP制备与CEase抑制活性筛选
筛选具有较高胆固醇酯酶抑制活性的乳清蛋白肽，为纳米载体提供生物活性基础。
乳清蛋白经Alcalase酶解不同时间制备WPP，并测定水解度和CEase抑制率，选择2 h WPP用于后续纳米颗粒构建。
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具有内在胆固醇酯酶抑制活性的乳清蛋白肽自组装纳米颗粒增强豆甾醇生物可及性及降胆固醇效果
Whey Protein Peptides Self-Assembled Nanoparticles with Intrinsic Cholesterol Esterase Inhibition Enhance Stigmasterol Bioaccessibility and Hypocholesterolemic Effects
实验完整度
高包含体外纳米颗粒表征、模拟消化、分子对接及高脂饮食小鼠体内功能验证等多层级证据
主要模型
C57BL/6J 小鼠高脂饮食模型 WPP 自组装纳米颗粒 模拟胃肠消化体系
重点核对
St@WPP 的 St:WPP 质量比优化为6.4:20 St@WPP 灌胃剂量为528 mg/kg/day，其中含 St 128 mg/kg/day HFD 模型喂养高脂饮食（60 kcal% fat, D12492） 每组小鼠样本量：建模期 n=10，生化/病理/菌群分析 n=6 阳性对照为辛伐他汀 5 mg/kg
摘要
背景：豆甾醇（St）作为一种天然降胆固醇剂具有前景，但其水溶性差和生物可及性低严重限制了其在功能食品中的应用。方法：本研究利用具有内在胆固醇酯酶（CEase）抑制活性的乳清蛋白肽（WPP）构建了负载St的自组装纳米颗粒。随后，我们研究了其理化性质和形成机制，并通过动物实验评估了其降胆固醇活性。结果：在非共价疏水和氢键相互作用的驱动下，优化的负载St的WPP纳米颗粒（St@WPP）（(234.47 ± 1.36) nm）实现了74.73% ± 2.19%的高包封率（EE）。这种纳米包封显著改善了St的分散性和储存稳定性，并在模拟胃肠消化后将其生物可及性从9.00% ± 0.14%显著提高至19.41% ± 0.69%。St@WPP给药有效改善了血脂异常，表现为血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低，这可能与肠道胆固醇可利用性降低和粪便胆固醇含量增加有关。此外，St@WPP减轻了肝脏脂肪变性，减弱了全身炎症，并重新平衡了肠道微生物群结构。结论：总体而言，WPP外壳作为递送载体，改善了St的水溶性和生物可及性，从而拓宽了其在低脂或水性食品体系中的应用潜力。所得的St@WPP表现出显著的降胆固醇活性，使其成为一种有前景的功能性食品成分，对胆固醇管理具有潜在益处。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用具有内在胆固醇酯酶抑制活性的乳清蛋白肽构建自组装纳米颗粒，以改善豆甾醇的水溶性、生物可及性并增强其降胆固醇效果？
- 核心机制
- WPP通过疏水作用和氢键驱动自组装形成纳米颗粒，将结晶态St转化为无定形包封态；WPP外壳同时具有CEase抑制活性，可能通过降低肠道胆固醇可利用性和增加粪便胆固醇排泄发挥降胆固醇作用。
- 主要证据
- 优化St@WPP粒径为234.47 ± 1.36 nm，EE为74.73% ± 2.19%，St生物可及性由9.00% ± 0.14%提高至19.41% ± 0.69%；高脂饮食小鼠中St@WPP降低血清TC和LDL-C、减轻肝脏脂肪变性、降低炎症因子并重塑肠道菌群和SCFAs。
- 研究意义
- 该研究为改善豆甾醇生物可及性提供了功能食品级纳米载递策略，并支持其在调节脂质代谢的功能食品中的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WPP与CEase相互作用预测
预测WPP中潜在CEase抑制肽及其与CEase活性位点的结合特征。
采用LC-MS/MS鉴定肽序列，并进行毒性、致敏性和肠道吸收预测；以CEase（PDB ID: 1CLE）为受体进行分子对接。
St@WPP自组装纳米颗粒制备与优化
构建并优化负载豆甾醇的WPP自组装纳米颗粒。
将St乙醇溶液滴加至2 h WPP溶液中，经剪切、超声、旋转蒸发去除乙醇并冻干，获得不同St:WPP质量比的St@WPP粉末。
St@WPP理化性质与储存稳定性表征
评估不同St:WPP质量比下纳米颗粒的粒径、表面电荷、包封率和载药量，并筛选最优配方。
采用DLS测定粒径和zeta电位，采用硫酸-磷酸-铁法测定EE和LC，并在4 °C储存21天观察外观稳定性。
体外模拟消化与St生物可及性评价
比较游离St与St@WPP在模拟胃肠消化后的生物可及性。
按照INFOGEST协议进行两阶段体外消化，消化后离心取上清作为水性生物可及部分，并测定St含量。
自组装机制与微观形貌分析
解析St在WPP纳米颗粒中的包封状态、分子间作用力和形貌特征。
采用FTIR、XRD、SEM和TEM分析St、WPP及St@WPP的非共价相互作用、结晶状态和微观结构。
高脂饮食小鼠降胆固醇功效评价
评估St@WPP在HFD诱导高脂血症小鼠中的降胆固醇、降脂、抗炎及肝脏保护作用。
C57BL/6J小鼠经HFD诱导后分组灌胃St@WPP、辛伐他汀或生理盐水，检测体重、脂肪组织、血清和肝脏脂质、肝功能、炎症因子及粪便胆固醇。
肝脏与脂肪组织病理分析
评价St@WPP对肝脏脂肪变性、炎症浸润和脂肪细胞肥大的影响。
取肝脏和附睾白色脂肪组织进行H&E染色，肝脏另进行Oil Red O染色，并进行脂肪变性评分和脂肪细胞直径测量。
肠道菌群与短链脂肪酸分析
评估St@WPP对HFD小鼠肠道菌群结构和SCFAs代谢的调节作用。
提取粪便DNA进行16S rDNA V3+V4区测序，并进行α多样性、β多样性和物种组成分析；同时采用GC-MS测定粪便SCFAs。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| WPP制备 | Alcalase® 2.4 L | Novonesis | -- |
| 乳清蛋白 | Hilmar Cheese Company, Inc. | -- | |
| St@WPP制备 | 豆甾醇 | Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. | -- |
| 剪切混合器 | FLUKO | FM200 | |
| 细胞破碎仪 | Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd. | SCIENTZ-IID | |
| 旋转蒸发仪 | -- | RE-2000B | |
| 冷冻干燥机 | Beijing Tianlin Hengtai Technology Co., Ltd. | LGJ-10 | |
| 水解度测定 | 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | GENESYS 10S |
| CEase抑制实验 | 酶标仪 | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd. | iMark |
| 粒径和zeta电位测定 | Zetasizer Nano ZS-90 | Malvern | -- |
| EE和LC测定 | 离心机 | -- | SF-TGL-18R |
| FTIR分析 | Nicolet iS 10 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| XRD分析 | D8 Advance | Bruker | -- |
| SEM分析 | Sigma 300 | Carl Zeiss AG | -- |
| TEM分析 | TECNAI G2 SPIRIT BIO | Fei | -- |
| 粪便胆固醇测定 | 总胆固醇测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute | -- |
| 血清和肝脏生化分析 | 酶联免疫吸附测定试剂盒 | Jiangsu Enzyme Exemption Industry Co., Ltd.; Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | -- |
| 粪便DNA提取 | 粪便DNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| DNA定量 | NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 16S rDNA测序 | Illumina Nextseq 2000 | Illumina | -- |
| SCFAs分析 | 8890-7000D气相色谱-质谱联用仪 | Agilent | -- |
| Agilent VF-WAXms毛细管柱 | Agilent | -- | |
| 动物实验 | 辛伐他汀 | Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| WPP制备与筛选 | Alcalase酶/底物比3000 U/g，55 °C酶解2 h，pH 8.0，85 °C灭酶20 min；2 h WPP用于后续纳米颗粒构建 阅读提示：Methods 2.2.1和2.2.3 |
| St@WPP制备与优化 | St:WPP质量比6.4:20为最优配方；St浓度8 mg/mL，WPP浓度20 mg/mL；剪切10,000 rpm 10 min；超声25 kHz 250 W 3 s on/3 s off总90 s；旋转蒸发45 °C 阅读提示：Methods 2.3和Results 3.2.3 |
| 体外模拟消化与生物可及性 | INFOGEST协议；胃阶段37 °C 2 h pH 3.0，pepsin 2000 U/mL，Ca2+ 0.075 mM；肠阶段37 °C 2 h pH 7.0，trypsin 100 U/mL，lipase 2000 U/mL，bile salts 10 mM，Ca2+ 0.3 mM；初始St浓度6.4 mg/mL 阅读提示：Methods 2.4.4 |
| 高脂饮食小鼠模型与给药 | 雄性C57BL/6J小鼠，5周龄，21.94 ± 0.19 g；HFD 60 kcal% fat D12492建模8周；分组NC、HFD、St@WPP 528 mg/kg/day（含St 128 mg/kg/day）、Simvastatin 5 mg/kg，n=10；灌胃0.1 mL/10 g b.w.每日一次 阅读提示：Methods 2.6 |
| 组织病理与菌群分析 | 肝脏和eWAT H&E染色及肝脏Oil Red O染色，每只1张切片4个随机视野，n=6；16S rDNA V3+V4区测序，引物338F/806R，每样本稀释至20,000 reads；SCFAs采用GC-MS测定 阅读提示：Methods 2.7.4、2.7.5和2.7.6 |