患者肺组织采集与分组
获取CPAM囊性病变区与配对组织学正常区组织，用于后续脱细胞与蛋白质组学比较。
收集经CT诊断并手术切除的CPAM患者肺标本，从囊性区（CPAM，n=4）和病灶周围组织学正常区（ND，n=4）取材。
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先天性肺气道畸形的脱细胞人肺细胞外基质的组成与功能
Composition and Function of Decellularized Human Lung Extracellular Matrix from Congenital Pulmonary Airway Malformation
实验完整度
高包含患者组织脱细胞、DIA蛋白质组学、多基因集分析与HUVEC再细胞化水凝胶功能验证。
主要模型
CPAM患者囊性肺组织与配对组织学正常肺组织（n=4对） 脱细胞人肺ECM支架 ND与CPAM肺脱细胞ECM水凝胶 HUVECs再细胞化模型
重点核对
四例CPAM患者均提供配对囊性区（CPAM，n=4）与组织学正常区（ND，n=4）肺组织，患者年龄7–24个月。 脱细胞流程依次使用0.1% Triton-X 100、0.1% SLES、0.1% Triton-X 100和ddH2O，每6小时更换。 脱细胞效率通过H&E染色、残留DNA（DNeasy Blood & Tissue Kit）和SEM评估，残留DNA <50 ng/mg。 DIA蛋白质组学使用Orbitrap Astral质谱仪与Vanquish Neo UHPLC，DIA-NN 1.8.1分析，差异表达以配对t检验p<0.05判定。 ECM水凝胶再细胞化使用HUVECs培养3天，通过calcein AM/碘化丙啶活死染色及rhodamine phalloidin/α-tubulin染色评估。
摘要
背景：先天性肺气道畸形（CPAM）是一种以囊性肺病变为特征的罕见发育障碍，但其细胞外基质（ECM）组成仍知之甚少。本研究采用脱细胞化和数据非依赖性采集（DIA）蛋白质组学，比较了四例患者肺中囊性（CPAM）区域与组织学正常的非病变（ND）区域的ECM图谱。结果：脱细胞支架保留了其天然结构，残留DNA极低（<50 ng/mg）。蛋白质组学分析揭示了431个差异表达蛋白（DEPs），其中171个在CPAM中上调，260个下调。关键发现揭示了CPAM特异性富集的胶原（COL4A6、COL4A2、COL10A1、COL21A1和PIIINP）、糖蛋白（SPP1、FRAS1、FREM1、FREM2、LTBP1和FBLN7）、ECM调节因子（TENM2、ROR2和OMD）以及ECM相关蛋白（ANXA7），同时糖蛋白（VASN和ABI3BP）、蛋白聚糖（PODN和MXRA7）、ECM调节因子（SCARA5、PAPPA、SAA4、CPXM1、CTSC、THY1、SERPINA6/A1/D1、BSG、LYVE1、ITIH4和CD44）以及ECM相关蛋白（LGALSL）下调。通路分析强调了CPAM中TGF-β、PI3K–AKT和mTOR信号通路的失调以及异常ECM–细胞相互作用在发病机制中的作用。我们还评估了它们的功能特性，并研究了基于ECM的水凝胶对再细胞化的影响。结论：这些发现提供了CPAM ECM改变的综合蛋白质组图谱，为疾病机制和潜在治疗靶点提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CPAM囊性病变区域的细胞外基质组成与组织学正常肺区域相比有何差异，这些差异对细胞行为有何影响？
- 核心机制
- CPAM中TGF-β、PI3K–AKT和mTOR信号通路失调，伴随ECM–细胞相互作用异常，可能与发病机制相关。
- 主要证据
- 四对CPAM与ND脱细胞肺组织的DIA蛋白质组学鉴定出431个DEPs（171上调、260下调），通路富集显示TGF-β、PI3K–AKT、mTOR等通路上调，GSE190620转录组数据验证及HUVEC水凝胶再细胞化显示ND水凝胶上细胞存活与黏附更优。
- 研究意义
- 提供了CPAM ECM改变的综合蛋白质组图谱，为疾病机制提供探索性见解和潜在治疗靶点，并提示脱细胞ECM可用于先天性肺疾病建模及未来生物材料研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人肺组织脱细胞化
去除细胞成分，获得保留天然结构的ECM支架，用于ECM蛋白提取和后续分析。
将肺组织置于OCT中快速冷冻，切取20 μm厚切片，依次用PBS、ddH2O及去垢剂处理进行脱细胞。
DIA蛋白质组学分析
全面比较CPAM与ND脱细胞肺ECM的蛋白质组成差异。
提取脱细胞ECM蛋白，经FASP酶切和C18除盐后进行LC–MS/MS DIA采集，分析差异表达蛋白及通路。
生物信息学与公共数据验证
注释差异蛋白、富集通路并通过公共转录组数据验证蛋白质组发现。
利用UniProtKB/Swiss-Prot、KEGG、GO进行注释和Fisher精确检验富集分析，构建PPI网络，并分析GSE190620数据集。
脱细胞ECM水凝胶制备与体外再细胞化
评估CPAM与ND来源ECM水凝胶对细胞形态、存活和增殖的影响。
将脱细胞ECM酶解制备水凝胶，铺于24孔板成胶后接种HUVECs，培养3天后进行活死染色和细胞骨架染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脱细胞与DNA残留检测 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| 扫描电子显微镜 | Hitachi S-4800扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | BeyoTime | -- |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 肽段浓度测定 | Nanodrop One微量核酸蛋白测定仪 | Thermo | -- |
| LC–MS/MS | Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 50 cm低负载µPAC™ Neo HPLC色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| 水凝胶制备 | 猪胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞骨架染色 | 罗丹明鬼笔环肽溶液 | Cytoskeleton | -- |
| 免疫荧光 | α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP |
| 活死细胞染色 | 钙黄绿素AM/碘化丙啶荧光染色剂 | Solarbio | -- |
| 荧光显微成像 | Axio Observer D1/AX10 cam HRC荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者组织采集与分组 | 患者数量（n=4）、年龄7–24个月、配对囊性区与组织学正常区取材、纳入与排除标准 阅读提示：查阅Materials and Methods 2.1 Human Lung Tissue Collection及Table 1患者信息 |
| 脱细胞化 | 去垢剂种类与浓度（0.1% Triton-X 100、0.1% SLES）、处理时间（每6 h）、切片厚度20 μm、残留DNA检测方法 阅读提示：查阅Materials and Methods 2.2 Human Lung Decellularization及Figure 1图注 |
| DIA蛋白质组学 | 蛋白提取缓冲液、胰蛋白酶消化比例50:1、37 °C过夜、LC–MS/MS梯度、质谱参数（DIA扫描范围、NCE 25、AGC参数） 阅读提示：查阅Materials and Methods 2.3 Astral DIA Proteomic Analysis of Decellularized ECM |
| 生物信息学分析 | GO/KEGG富集统计阈值（q < 0.05）、PPI数据库与软件版本、公共验证数据集GSE190620 阅读提示：查阅Materials and Methods 2.4 Bioinformatics Analysis及Supplementary Figures S2–S7 |
| ECM水凝胶制备与再细胞化 | 猪胃蛋白酶浓度2 g/L、消化时间48 h、pH滴定范围7.2–7.4、HUVECs培养3天、染色浓度与抗体稀释比 阅读提示：查阅Materials and Methods 2.5 Lung Decellularized ECM Hydrogel Evaluation及Figure 8图注 |