OM和BM Mφ的分离与纯化
从新生小鼠颅骨和骨髓中分别获得高纯度的OM和BM Mφ。
新生小鼠颅骨经EDTA和胶原酶消化获得颅骨细胞（NCC），新生骨髓经冲洗、裂解红细胞获得骨髓细胞（NBM）；通过流式细胞术分选CD45+F4/80+细胞，分别作为OM和BM Mφ。
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新生儿骨巨噬细胞与骨髓巨噬细胞在表型标记物表达和功能上的差异
Neonatal Osteomacs and Bone Marrow Macrophages Differ in Phenotypic Marker Expression and Function
实验完整度
高包含单细胞qRT-PCR、CyTOF、体外增殖实验、破骨细胞分化实验、吞噬实验及QPCR验证，涉及多个证据层级（基因、蛋白、功能）。
主要模型
新生C57Bl/6小鼠颅骨来源的骨巨噬细胞（OM） 新生C57Bl/6小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BM Mφ） CD166基因敲除（CD166−/−）新生小鼠的OM和BM Mφ
重点核对
MCSF浓度：20 ng/ml，用于增殖和破骨细胞分化实验 RANKL浓度：80 ng/ml，用于破骨细胞分化实验 TPO浓度：100 ng/ml，用于破骨细胞分化实验 LPS浓度：100 ng/ml，用于M1极化；IL-4和IL-10浓度：各10 ng/ml，用于M2极化 破骨细胞鉴定：TRAP染色，计数多核（≥3个核）细胞
摘要
骨巨噬细胞（OM）是骨组织中的特化巨噬细胞，是造血微环境的组成部分，支持骨形成。骨髓微环境中还存在第二类巨噬细胞，即骨髓来源的巨噬细胞（BM Mφ）。我们此前报道，OM的一个亚群共表达CD166和CSF1R（MCSF的受体），并且OM比BM Mφ形成更多的骨吸收破骨细胞。本文报道了通过单细胞qRT-PCR、CyTOF和标记物特异性功能研究，进一步鉴定新生C57Bl/6小鼠OM和BM Mφ之间的差异。尽管OM表达更高水平的CSF1R和MCSF，它们对MCSF诱导的增殖无反应，而BM Mφ则对MCSF诱导的增殖有反应。此外，仅加入RANKL而不加MCSF就足以诱导OM形成破骨细胞，但在BM Mφ培养中则不能。OM表达的CD166水平高于BM Mφ，我们发现CD166−/− OM的破骨细胞形成较野生型（WT）OM减少，而CD166−/− BM Mφ的破骨细胞形成增强。CD110/c-Mpl（促血小板生成素(TPO)的受体）在OM中表达也更高，但TPO并未改变OM来源的破骨细胞形成，而TPO刺激了BM Mφ的破骨细胞形成。CyTOF分析显示，OM独特地共表达CD86和CD206，分别是M1和M2极化巨噬细胞的标志物。OM在LPS或IL-4/IL-10诱导的M1和M2极化后，其吞噬能力相当，而BM Mφ在极化为M2亚型后吞噬能力较差。此外，与BM Mφ相比，LPS处理OM导致CD80（M1标志物）以及IL-10和IL-6（已知的抗炎细胞因子）的上调。总之，这些数据揭示OM和BM Mφ是巨噬细胞的不同亚群，它们在增殖、吞噬和破骨细胞形成方面的表型和功能差异可能在健康和疾病期间贡献生理特异性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 新生儿骨巨噬细胞（OM）与骨髓巨噬细胞（BM Mφ）在表型标记物和功能（增殖、吞噬、破骨细胞形成）上是否存在差异？
- 核心机制
- OM高表达CSF1R和MCSF，可能通过自分泌/旁分泌MCSF/CSF1R信号，使其增殖不依赖外源MCSF，且仅需RANKL即可诱导破骨细胞形成；CD166和CD110在OM和BM Mφ中对破骨细胞形成具有不同的调节作用。
- 主要证据
- 单细胞qRT-PCR显示OM中CSF1R、MCSF、CD110等基因表达显著高于BM Mφ；CyTOF和流式细胞术显示OM表达CD166、CD110、CD206和CD86；功能实验显示OM对MCSF诱导的增殖无反应，而BM Mφ有反应；OM仅用RANKL即可形成破骨细胞，而BM Mφ需要MCSF和RANKL；CD166−/− OM的破骨细胞形成减少，而CD166−/− BM Mφ增强；TPO刺激BM Mφ破骨细胞形成但不影响OM；OM在M1/M2极化后吞噬能力不变，而BM Mφ在M2极化后吞噬能力降低。
- 研究意义
- 这些发现表明OM和BM Mφ是功能上不同的巨噬细胞亚群，可能在健康和疾病中发挥不同的生理作用，未来需要识别可靠的区分标志物以设计体内功能研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞基因表达分析
比较OM和BM Mφ在单细胞水平上90个基因的表达差异。
使用Fluidigm C1系统捕获单细胞，反转录并预扩增，在BioMark HD系统上进行qPCR，分析90个基因的表达，比较两组间的差异。
质谱流式细胞术（CyTOF）分析
从蛋白水平鉴定OM和BM Mφ的表面和胞内标记物差异。
使用包含17种表面和13种胞内抗体的panel，通过CyTOF 2质谱流式细胞仪分析OM和BM Mφ，用FlowSOM和viSNE进行聚类和可视化。
细胞增殖实验
检测OM和BM Mφ在基础状态和MCSF刺激下的增殖能力。
将分选的OM和BM Mφ以25,000细胞/孔接种于96孔板，在有无MCSF（20 ng/ml）条件下培养24和48小时，用MTS法和细胞计数检测增殖。
破骨细胞分化实验
比较OM和BM Mφ在MCSF和RANKL诱导下的破骨细胞形成能力，并评估CD166和CD110(TPO)的作用。
将分选的OM和BM Mφ以7,500-15,000细胞/孔接种，在αMEM+10%FBS中加入MCSF和RANKL培养5-7天，TRAP染色计数破骨细胞；或在RANKL单独存在下培养验证自分泌；或用CD166敲除小鼠的细胞或添加TPO（100 ng/ml）处理。
吞噬实验
检测OM和BM Mφ在基础状态及M1/M2极化后的吞噬能力。
将细胞以75,000-100,000细胞/孔接种，培养过夜；用LPS（100 ng/ml）诱导M1极化，或用IL-4+IL-10（各10 ng/ml）诱导M2极化，处理24或48小时后，加入pHrodo™ Red BioParticles®共孵育1-2小时，用ImageStream分析吞噬。
基因表达分析（QPCR）
验证表型标记物（CD86、CD80、Arg1）及细胞因子（IL-6、IL-10）在静息和极化状态下的表达差异。
提取总RNA，反转录后使用SYBR Green或Taqman探针进行QPCR，以GAPDH为内参，计算2ΔCt值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分选 | CD45抗体 | Biolegend | -- |
| F4/80抗体 | Biolegend | -- | |
| 流式分析 | CD110（生物素化单克隆抗体） | Takara Bio | -- |
| 链霉亲和素偶联Pacific Blue | Biolegend | -- | |
| 单细胞qRT-PCR | C1单细胞自动制备系统 | Fluidigm | -- |
| BioMark HD系统 | Fluidigm | -- | |
| CyTOF分析 | Cell-ID顺铂活力染色 | DVS Sciences (Fluidigm) | -- |
| Fc受体封闭剂 | Biolegend | -- | |
| Maxpar Perm-S缓冲液 | DVS Sciences (Fluidigm) | -- | |
| Cell-ID铱嵌入剂 | DVS Sciences (Fluidigm) | -- | |
| EQ校准微球 | DVS Sciences (Fluidigm) | -- | |
| CyTOF 2质谱流式细胞仪 | DVS Sciences (Fluidigm) | -- | |
| 细胞增殖实验 | CellTiter 96® AQueous非放射性细胞增殖检测试剂盒（MTS） | Promega | G5421 |
| BioTek Cytation 5成像酶标仪 | BioTek | -- | |
| 破骨细胞分化 | 重组小鼠MCSF | Peprotech | -- |
| 重组小鼠RANKL | Peprotech | -- | |
| TRAP染色试剂盒 | Sigma | -- | |
| 吞噬实验 | pHrodo™ Red BioParticles® | Life Technologies | -- |
| 脂多糖内毒素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 白细胞介素-10 | -- | -- | |
| ImageStream（Amnis） | Amnis | -- | |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | -- |
| QPCR | Fast SYBR™ Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Taqman Fast Advance master mix | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与分选 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（新生3-5天）、组织来源（颅骨、骨髓）、细胞标记（CD45、F4/80） 阅读提示：Methods: Preparation of OM and neonatal calvarial cells (NCC) and neonatal bone marrow (NBM); Cell staining, flow cytometry, and cell sorting |
| 单细胞qRT-PCR | 细胞数量（200,000 cells/ml）、捕获芯片型号（C1 IFC 10-17μm用于OM，5-10μm用于BM Mφ）、基因数（90） 阅读提示：Methods: Single cell qRT-PCR |
| CyTOF分析 | 抗体panel（17表面+13胞内）、Brefeldin A浓度（10 μg/ml，处理3小时）、细胞数量（3.5 million）、仪器（CyTOF 2） 阅读提示：Methods: Mass cytometry (CyTOF) |
| 细胞增殖实验 | 细胞数量（25,000细胞/孔）、MCSF浓度（20 ng/ml）、培养时间（24、48小时） 阅读提示：Methods: Cell proliferation assays; Figure 3 legend |
| 破骨细胞分化实验 | 细胞数量（7.5×10^3-1.5×10^4/孔）、MCSF浓度（20 ng/ml）、RANKL浓度（80 ng/ml）、TPO浓度（100 ng/ml，如适用）、培养时间（5-7天）、TRAP染色鉴定标准（≥3个核） 阅读提示：Methods: Osteoclast differentiation; Figure 4 and 5 legends |
| 吞噬实验 | 细胞数量（7.5×10^4-1×10^5/孔）、MCSF浓度（10 ng/ml）、LPS浓度（100 ng/ml）、IL-4和IL-10浓度（各10 ng/ml）、处理时间（24或48小时）、pHrodo BioParticles孵育时间（1-2小时） 阅读提示：Methods: Phagocytosis assay; Figure 6 legend |
| QPCR实验 | 引物序列（Supplemental Table 2）、内参基因（GAPDH）、计算方式（2ΔCt） 阅读提示：Methods: RNA extraction and QPCR analysis; Figure 7 legend |