经典训练免疫及急性炎症模型建立
验证SIRT3是否抑制HSC对经典训练免疫、急性炎症和肌肉功能的反应。
3月龄Mx1-T3与Mx1-Cre小鼠接受β-glucan处理，24小时后通过流式检测HSC ROS、Ki-67、MPP3和外周血谱系分化；另一组β-glucan后7天给予LPS，检测血清TNF-α、IL-6及倒置屏幕测试。
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训练免疫将造血干细胞衰老与衰老相关炎症联系起来
Trained immunity links hematopoietic stem cell aging to aging-associated inflammation
实验完整度
高包含体外HSC分化、竞争性骨髓移植、过继转移及ATAC-seq/RNA-seq等多层级功能与机制验证
主要模型
Mx1-T3小鼠（造血系统过表达SIRT3）与Mx1-Cre对照 LysM-T3小鼠（髓系细胞过表达SIRT3）与LysM-Cre对照 竞争性骨髓移植及二次移植的CD45.1 B6.SJL受体小鼠 过继转移的脾细胞、T细胞和髓系细胞及年轻WT受体小鼠
重点核对
β-glucan训练剂量1 mg及LPS刺激10 μg，血清于LPS后1.5小时采集 竞争性移植中注射250个HSC与5×10^5 CD45.1竞争者骨髓细胞，致死剂量950 cGy照射 过继转移脾细胞3×10^6、T或髓系细胞2×10^6，逆眼眶注射 IL-1β抗体或IgG剂量4 mg/kg，过继转移前给药并每周重复两次 5-氟尿嘧啶150 mg/kg每周一次腹腔注射
摘要
训练免疫是一种在造血干细胞（HSCs）中启动、主要由其髓系后代介导的免疫反应增强状态。衰老相关炎症驱动许多衰老相关疾病，但其生物学起源在很大程度上未知。在此，我们显示，SIRT3——一种在HSCs中高表达但在衰老过程中降低的线粒体去乙酰化酶——抑制HSCs对衰老的反应，该反应驱动小鼠中适应不良的训练免疫、慢性炎症和组织功能衰退。在HSCs中过表达SIRT3不仅改善衰老相关的HSC衰退，还通过具有调节性炎症程序的髓系细胞改善远端组织的功能，包括减轻认知和运动能力的年龄相关下降。这些发现揭示，HSC衰老是通过适应不良的训练免疫驱动衰老相关炎症的因素，并拓宽了靶向HSCs的可能临床应用，从血液疾病扩展到对抗衰老相关生理衰退和改善健康寿命。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老相关炎症的生物学起源是什么，以及HSC衰老是否通过适应不良的训练免疫驱动衰老相关炎症和远端组织功能衰退。
- 核心机制
- HSC对衰老的反应启动表观遗传炎症训练（适应不良训练免疫），产生具有炎症表型的髓系细胞进入循环，驱动衰老相关慢性炎症和远端组织功能衰退；SIRT3过表达抑制该过程。
- 主要证据
- 老年Mx1-T3小鼠HSC的ROS降低、增殖减少、髓系偏向分化减弱，血清TNF-α和IL-6降低，肌肉和认知功能改善；过继转移SIRT3过表达HSC来源的髓系细胞可减轻炎症并改善组织功能；ATAC-seq、单核ATAC-seq和Cut&Tag-seq显示染色质可及性及H3K4me3/H3K18la在炎症通路上改变。
- 研究意义
- 研究提示HSC衰老是通过适应不良训练免疫驱动衰老相关炎症和生理衰退的机制，并支持利用HSCs缓解衰老相关状况、改善健康寿命的潜在应用方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外HSC分化及髓系细胞训练免疫
验证SIRT3是否优先在HSC阶段抑制训练免疫。
从β-glucan或PBS处理的Mx1-T3和Mx1-Cre小鼠分离lineage-negative细胞，体外分化为髓系细胞，给予β-glucan和LPS刺激，检测细胞因子产生。
老年HSC竞争性骨髓移植
验证SIRT3过表达是否改善老年HSC的再造和维持功能。
从2岁Mx1-T3和Mx1-Cre小鼠分选HSC，与CD45.1 B6.SJL竞争者骨髓混合后移植到致死照射受体，评估多谱系重建、ROS、增殖、死亡和二次移植。
老年小鼠炎症及组织功能评估
验证SIRT3过表达是否减轻衰老相关慢性炎症和远端组织功能衰退。
对2岁Mx1-T3和Mx1-Cre小鼠检测外周血髓系比例、血清TNF-α和IL-6、组织CD68+巨噬细胞、跑步机耐力、倒置屏幕和体重。
HSC移植后长期衰老及远端组织功能
验证HSC来源的SIRT3过表达是否足以改善远端组织功能。
将Mx1-T3或Mx1-Cre骨髓移植到3月龄WT受体，衰老至24个月，检测巨噬细胞、肌肉转录组、跑步机、倒置屏幕、Barnes迷宫、旷场、高架十字迷宫、葡萄糖代谢、肺H&E和衰老标志物。
过继转移脾细胞及IL-1β阻断
验证衰老免疫细胞是否通过系统性炎症级联损害组织功能，以及IL-1β的作用。
将年轻或老年WT小鼠脾细胞过继转移到年轻WT受体，检测血清IL-6、组织CD68和IL-6、肌肉功能及葡萄糖耐量；部分受体接受IL-1β中和抗体或IgG。
HSC来源脾细胞、T细胞和髓系细胞过继转移
验证SIRT3过表达HSC来源的髓系细胞是否介导远端组织功能改善。
将2岁Mx1-T3或Mx1-Cre HSC重建小鼠的脾细胞、T细胞或髓系细胞过继转移到年轻WT受体，检测组织巨噬细胞、IL-6、肌肉功能、葡萄糖耐量和肺泡大小。
表观遗传炎症训练分析
验证SIRT3是否调控HSC中衰老相关表观遗传炎症训练。
对2岁Mx1-T3和Mx1-Cre小鼠HSC进行ATAC-seq、lineage-negative细胞单核ATAC-seq及H3K4me3/H3K18la Cut&Tag-seq，分析染色质可及性和组蛋白修饰。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 诱导Cre重组酶活性 | 聚肌胞苷酸 | SIGMA | P1530 |
| 体内药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | Calbiochem | 343922 |
| 动物饲养 | 啮齿动物饲料5053 | LabDiet | -- |
| 流式细胞术 | CD45.2抗体 | BioLegend | 109830 |
| CD45.1抗体 | BioLegend | 110728 | |
| Mac1抗体 | BioLegend | 101208 | |
| Gr1抗体 | BioLegend | 108406 | |
| B220抗体 | BioLegend | 103212 | |
| CD3抗体 | BioLegend | 100214 | |
| 过继转移 | ACK裂解缓冲液 | Gibco | A10492–01 |
| CD3ε微珠 | Miltenyi Biotec | 130-094-973 | |
| CD11b微珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| IL-1β抗体阻断 | IL-1β抗体 | Bio X Cell | BE0246 |
| 免疫球蛋白G | Bio X Cell | BE0091 | |
| 诱导训练免疫 | β-葡聚糖 | Sigma | G5011 |
| 脂多糖 | Sigma | L5668–1ML | |
| 体外训练免疫 | 谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-110-470 |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315–02 | |
| 流式细胞术 | BD FACS裂解液 | BD | 349202 |
| 谱系抗体混合物 | BioLegend | 101226, 108424, 116223, 100222, 100414, 100714, 103224, 105812, 108120, 103404, 115904 | |
| H2DCFDA | Invitrogen | D399 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420404 | |
| Ki-67抗体 | BioLegend | 652409 | |
| Flt3抗体 | BioLegend | 103236, 100218, 100434, 100734, 108428, 101228, 116228, 105826, 135310 | |
| 细胞分选 | c-Kit微珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-224 |
| 碘化丙啶 | BioLegend | 421301 | |
| 组织切片 | Tissue-Plus™ O.C.T.包埋剂 | Fisher | 23-730-571 |
| 免疫组织化学 | FITC抗CD192（CCR2）抗体 | BioLegend | 150607 |
| PE抗CD11b抗体 | BioLegend | 101208 | |
| 抗CD68抗体 | BioLegend | 137001 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123101 | |
| 抗IL-6（D5W4V）抗体 | Cell Signaling | 12912S | |
| 用于CD68、F4/80、IL-6的二抗 | Invitrogen | SA5–10018, A21434, A11036 | |
| DAPI | Thermo Fisher | 62247 | |
| 细胞因子检测 | Luminex®小鼠IL-6和TNF-α细胞因子免疫测定 | Millipore | MCYTOMAG-70K |
| IL-6酶联免疫吸附试剂盒 | R&D | M6000B-1 | |
| TNF-α酶联免疫吸附试剂盒 | BioLegend | 430907 | |
| SA-β-gal染色 | β-半乳糖苷酶染色检测试剂盒 | CST | 9860 |
| RT-qPCR | TRIzol | Invitrogen | 15596018 |
| qScript cDNA SuperMix | Quanta | 95048 | |
| EvaGreen qPCR SuperMix试剂盒 | BioChain | K5052400 | |
| 葡萄糖耐量测试 | CONTOUR NEXT血糖仪 | -- | -- |
| 跑步机力竭测试 | Exer-6M开放式跑步机 | Columbus Instruments | -- |
| ATAC测序 | StemSpan SFEM培养基 | StemCell Technologies | 09600 |
| ES-Cult胎牛血清 | StemCell Technologies | 06952 | |
| HSC培养 | 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140122 |
| IL3 | PeproTech | 213–13 | |
| IL-6 | PeproTech | 216–16 | |
| TPO | PeproTech | 250–31L | |
| Flt3L | PeproTech | 315–14 | |
| SCF | PeproTech | 250–03 | |
| RNA测序 | RNeasy Plus Micro试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| QuantSeq 3’ mRNA-Seq文库制备试剂盒FWD | Lexogen | -- | |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Cut&Tag测序 | CUT&Tag-IT检测试剂盒 | Active Motif | 53160 |
| 抗H3K18la兔单克隆抗体 | PTMBIO | PTM-1406RM | |
| 抗H3K4me3 | Active Motif | 39159 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 经典训练免疫诱导 | β-glucan剂量1 mg、LPS剂量10 μg、LPS于β-glucan后7天、血清采集时间1.5小时、倒置屏幕测试时间4小时、每组n=6 阅读提示：Methods中“Induction of trained immunity”小节及Figure 1图注 |
| 竞争性骨髓移植 | 供体HSC年龄2岁、250个HSC（CD45.2）、竞争者骨髓5×10^5 CD45.1、受体接受950 cGy照射、移植后每月流式检测4个月 阅读提示：Methods中“Transplantation assays”小节及Extended Data Figure 2图注 |
| 过继转移及IL-1β阻断 | 脾细胞3×10^6、T或髓系细胞2×10^6、IL-1β抗体或IgG 4 mg/kg、过继转移前给药并每周两次、受体年龄3月龄、分析时间6周或2周 阅读提示：Methods中“Adoptive transfer”小节及Figure 4、5、6、7图注 |
| HSC长期移植衰老模型 | 供体骨髓来源Mx1-T3或Mx1-Cre、受体3月龄WT、衰老至24个月、行为学测试和RNA-seq n=4 阅读提示：Figure 3图注及Methods中“Transplantation assays”小节 |
| 表观遗传测序 | HSC来源2岁Mx1-T3和Mx1-Cre小鼠、ATAC-seq使用50,000 HSC、Cut&Tag-seq使用100,000 HSC、H3K18la抗体1:50、H3K4me3抗体1:50、单核ATAC-seq n=3 阅读提示：Methods中“ATAC-sequencing”、“Single-nuclei ATAC-sequencing”和“Cut&Tag-sequencing”小节及Figure 8图注 |