检测UBE2M在肿瘤内皮细胞中的表达
明确UBE2M在肿瘤血管内皮及尖端细胞中是否表达上调
对B16黑色素瘤、LLC肿瘤及配对正常组织进行CD31与UBE2M免疫荧光染色；对临床肺癌组织切片进行免疫荧光染色；分析GSE118904和GSE159013数据集。
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内皮细胞缺失类泛素化E2酶UBE2M通过促进非生产性血管生成抑制肿瘤生长
Endothelial deletion of the neddylation E2 enzyme UBE2M inhibits tumor growth by promoting non-productive angiogenesis
实验完整度
高包含体外HUVEC模型、条件性内皮UBE2M敲除小鼠肿瘤模型、Matrigel plug assay、临床肺癌样本及单细胞/RNA-seq数据集分析，并有质谱、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因等机制验证。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVEC） HEK293T细胞 Ube2miECKO条件性内皮UBE2M敲除小鼠（C57BL/6） B16黑色素瘤及LLC皮下肿瘤模型、E0771原位乳腺癌模型
重点核对
UBE2M在肿瘤内皮细胞及尖端细胞中表达升高（免疫荧光、GSE118904、GSE159013） 内皮UBE2M缺失导致B16黑色素瘤和E0771乳腺癌生长受抑，但LLC皮下肿瘤生长不受影响 内皮UBE2M缺失导致血管密度增加、平均血管长度缩短、灌注受损及渗漏增加 UBE2M介导STAT1在Lys703位点类泛素化，促进Tyr701磷酸化及DLL4转录 内皮DLL4再表达可恢复Ube2miECKO小鼠肿瘤生长、血管灌注并减少尖端细胞比例
摘要
类泛素化（neddylation）在多种人类癌症中高度激活，可能成为临床治疗的治疗靶点。然而，类泛素化在肿瘤血管生成中的作用仍不清楚。在此，我们证明类泛素化E2酶UBE2M在尖端细胞（tip cell）中表达上调，并且是肿瘤血管出芽所必需的。我们发现，UBE2M介导的STAT1类泛素化增强了其磷酸化并促进DLL4的转录。尖端细胞中DLL4表达的升高激活了相邻柄细胞（stalk cell）中的Notch信号，从而维持尖端-柄细胞平衡并确保有序的血管模式化。因此，内皮细胞特异性缺失UBE2M降低了DLL4表达，导致由于尖端细胞形成失控和缺乏柄细胞支持而出现的过度但非生产性出芽，最终抑制肿瘤生长。重要的是，靶向内皮类泛素化可有效增敏多种肿瘤对抗VEGF治疗。总之，我们的发现揭示了UBE2M是血管生成信号的关键调节因子，并将其确定为癌症中一个有前景的抗血管生成靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 类泛素化E2酶UBE2M在肿瘤血管生成中的作用及其分子机制尚不清楚，本研究旨在探究内皮UBE2M如何调控肿瘤血管出芽及肿瘤生长。
- 核心机制
- UBE2M介导STAT1在Lys703位点发生类泛素化，增强STAT1 Tyr701磷酸化及其转录活性，促进DLL4表达；尖端细胞中DLL4升高激活相邻柄细胞的Notch信号，维持尖端-柄细胞平衡和有序血管模式化。
- 主要证据
- 在HUVEC中敲低/过表达UBE2M、使用MLN4924及STAT1-K703R突变体，结合质谱、变性免疫共沉淀、Western blot、qPCR和荧光素酶报告基因验证STAT1类泛素化与DLL4转录；在Ube2miECKO小鼠B16、E0771和LLC肿瘤模型中通过免疫荧光、微CT血管造影、激光散斑及灌注实验验证血管表型。
- 研究意义
- 研究揭示UBE2M是血管生成信号的关键调节因子和有前景的抗血管生成靶点；靶向内皮类泛素化可抑制肿瘤生长并增敏抗VEGF治疗，为临床抗血管生成治疗提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建内皮细胞特异性UBE2M敲除小鼠并评估肿瘤生长
验证内皮UBE2M缺失对肿瘤生长的影响
将Ube2mfl/fl小鼠与Cdh5-CreERT2小鼠杂交获得Ube2miECKO小鼠，他莫昔芬诱导敲除后接种B16、E0771或LLC肿瘤细胞，测量肿瘤体积和重量，并进行H&E、TUNEL、Hypoxyprobe-1和Ki67染色。
评估肿瘤血管结构与功能
明确内皮UBE2M缺失导致的血管形态和功能改变
通过CD31免疫荧光、微CT血管造影、激光散斑对比成像、lectin和dextran灌注实验及Matrigel plug assay评估血管密度、长度、分支、灌注和渗漏。
体外评估UBE2M对 endothelial 细胞功能的影响
明确UBE2M对 endothelial 细胞增殖、迁移、成管和出芽能力的影响
在HUVEC中通过慢病毒敲低或过表达UBE2M，进行CCK-8、Transwell迁移、划痕愈合、成管和微珠出芽实验；并用MLN4924处理。
验证UBE2M调控DLL4表达
探究UBE2M是否通过DLL4影响血管出芽
在UBE2M敲低/过表达或MLN4924处理的HUVEC中检测DLL4蛋白和mRNA；在Ube2miECKO小鼠B16、E0771和LLC肿瘤中检测内皮DLL4表达。
DLL4再表达挽救实验
验证DLL4是否是UBE2M下游关键效应分子
在Ube2miECKO小鼠肿瘤内注射Cre诱导的AAV-DLL4，随后他莫昔芬诱导UBE2M敲除并表达DLL4，评估肿瘤生长、缺氧、坏死、血管面积、长度、灌注和尖端细胞比例。
鉴定STAT1为UBE2M的类泛素化底物并验证机制
明确UBE2M调控DLL4的分子机制
用质谱筛选HUVEC中NEDD8结合蛋白，结合转录因子数据库预测DLL4转录因子；通过变性免疫共沉淀、Western blot、qPCR和荧光素酶报告基因验证STAT1类泛素化位点及对DLL4的转录调控。
评估靶向内皮UBE2M联合抗VEGF治疗的疗效
探究UBE2M缺失是否增敏抗VEGF治疗
在肿瘤生长至5 mm时诱导UBE2M敲除，随后每日口服cediranib或联合MLN4924处理，评估B16、E0771和LLC肿瘤生长、血管密度及周细胞覆盖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| M199培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 人内皮无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 内皮细胞生长补充剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 慢病毒包装与感染 | PSP质粒 | Addgene | 12260 |
| PMD质粒 | Addgene | 12259 | |
| PLVX-PURO质粒 | Takara Bio | 632164 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Pall | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD31抗体 | Servicebio | GB150217-100 |
| 抗CD31抗体 | R&D Systems | AF3628 | |
| Western blot与免疫荧光 | 抗UBE2M抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390064 |
| 抗DLL4抗体 | Cell Signaling Technology | 2589 | |
| 免疫荧光 | 抗DLL4抗体 | R&D Systems | AF1389 |
| Western blot | 抗STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9172 |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8394 | |
| 免疫荧光 | 抗CXCR4抗体 | Abcam | ab124824 |
| 体内缺氧检测 | Hypoxyprobe-1缺氧探针 | Hypoxyprobe, Inc. | HP1-100 |
| 免疫荧光 | Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| RNA提取与逆转录 | TRIzol试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | ReverTraAce qPCR逆转录试剂盒 | Toyobo Inc. | -- |
| LightCycler 480 II实时PCR系统 | Roche | -- | |
| 血管灌注与渗漏检测 | FITC标记葡聚糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 血管灌注检测 | DyLight 488标记番茄凝集素 | Vector Laboratories | -- |
| DyLight 649标记番茄凝集素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 微CT血管造影 | Microfil血管造影剂 | Flow Tech | -- |
| Matrigel plug实验 | 低生长因子Matrigel | Corning | -- |
| 重组小鼠FGF-2 | -- | -- | |
| VEGF-A | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 结晶紫 | Beyotime | -- | |
| 成管实验 | μ-Slide血管生成板 | Ibidi | -- |
| 钙黄绿素 | Yeasen | -- | |
| 出芽实验 | 微载体珠 | Cytiva | -- |
| 纤维蛋白原 | Solarbio | -- | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 凝血酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 药物处理 | MLN4924 | -- | -- |
| 西地尼布 | MCE | -- | |
| 乌帕替尼 | -- | -- | |
| MG132 | -- | -- | |
| DAPT | -- | -- | |
| 免疫荧光封片 | fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内皮UBE2M敲除小鼠诱导 | 他莫昔芬剂量20 mg/kg/d，腹腔注射5天，间隔1周后接种肿瘤 阅读提示：Methods中Mice小节及Mouse tumor models and treatment小节 |
| 皮下肿瘤接种 | B16或LLC细胞1×10^6个/100 μL PBS皮下接种；E0771细胞1×10^6个/100 μL PBS接种乳腺脂肪垫 阅读提示：Methods中Mouse tumor models and treatment小节 |
| cediranib联合治疗 | cediranib每日灌胃1.5 mg/kg，肿瘤建立后开始给药至取材 阅读提示：Methods中Mouse tumor models and treatment小节 |
| Matrigel plug实验 | Matrigel含FGF-2 400 ng/mL、VEGF-A 400 ng/mL和肝素50 units/mL，皮下注射后第7天取材 阅读提示：Methods中Matrigel plug assay小节 |
| 血管灌注与缺氧检测 | Hypoxyprobe-1 60 mg/kg静脉注射后循环60分钟；dextran 25 mg/mL、lectin 1 mg/mL静脉注射后循环30分钟 阅读提示：Methods中Pimonidazole stain, vascular leakage and perfusion assay小节 |
| HUVEC培养与慢病毒感染 | HUVEC使用第3至6代，培养于含10% FBS、1% P/S、53% M199、37%人内皮无血清培养基和15 mg/mL内皮细胞生长补充剂的完全M199中 阅读提示：Methods中Cells小节 |
| STAT1类泛素化位点验证 | 预测的5个赖氨酸位点K110、K673、K679、K697和K703，其中K703R突变几乎完全消除类泛素化 阅读提示：Results中Neddylation promotes the activity of the DLL4 transcription factor STAT1小节及Figure 8C |