细胞活力与联合效应评估
比较selinexor与JAK2抑制剂的抗增殖活性，并评估联合效果。
在MPN细胞系（HEL、UKE-1、ELF-153、Marimo）中处理selinexor、ruxolitinib、momelotinib、pacritinib 72小时，使用CellTiter-Glo®检测活力，计算IC50和Bliss协同评分。
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靶向骨髓纤维化中的核输出和Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路：一种影响内在和微环境相关通路的新型联合策略
Targeting nuclear export and Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT) signalling in myelofibrosis: A novel combinatorial strategy that impacts intrinsic and microenvironment-related pathways
实验完整度
高包含MPN细胞系、患者原代CD34+细胞和PBMC等多层级模型，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
JAK2V617F突变MPN细胞系（HEL、UKE-1） CALR突变MPN细胞系（Marimo） 无驱动突变MPN细胞系（ELF-153） MF患者原代CD34+细胞和外周血单个核细胞
重点核对
细胞系和原代细胞的药物处理浓度：selinexor 50-250 nM，ruxolitinib 50-100 nM 药物处理时间：细胞系24-72小时，原代细胞24小时 ruxolitinib耐药HEL细胞通过逐步增加药物浓度6周诱导，IC50增加>15倍 集落形成实验使用5例MF患者和5例正常供者CD34+细胞 NF-κB转录活性检测：TNFα刺激20 ng/mL 4小时，selinexor/ruxolitinib预处理2小时
摘要
骨髓纤维化（MF）是一种慢性骨髓增殖性肿瘤（MPN），以脾肿大、全身症状、骨髓纤维化、血细胞减少和炎症为特征。Janus激酶2（JAK2）抑制剂如ruxolitinib可减少脾肿大并缓解症状，但疾病修饰活性有限，且常出现耐药。Selinexor是一种口服选择性exportin（XPO1）抑制剂，可恢复肿瘤抑制因子和炎症信号抑制因子的核滞留。双重XPO1/JAK2抑制靶向互补的下游通路，增强对MF祖细胞适应度的抑制。我们在MF模型中评估了selinexor联合ruxolitinib，包括JAK2V617F或calreticulin（CALR）外显子9突变MPN细胞系以及MF患者样本。该联合方案比单独JAK2抑制表现出更强的抗增殖活性，并抑制MF CD34+细胞的集落形成。Selinexor在ruxolitinib耐药的MPN细胞系中仍保持活性，诱导G1期阻滞和凋亡。多组学分析显示p53核滞留增加，核因子κB（NF-κB）和Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路受到破坏，补充并扩展了ruxolitinib靶向的通路。该联合方案抑制NF-κB转录活性，并减少MF患者外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）。这些发现强调selinexor联合ruxolitinib影响MF造血细胞内在和微环境相关通路，提供了一种新型疾病修饰策略，具有改善MF患者临床结局的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在阐明selinexor联合ruxolitinib在MPN细胞系和MF患者原代细胞中影响的特定分子通路，并评估其克服JAK2抑制剂耐药的潜力。
- 核心机制
- Selinexor抑制XPO1，导致p53等肿瘤抑制因子核滞留，并破坏NF-κB和JAK/STAT信号通路；与ruxolitinib联用进一步增强这些通路的抑制，影响MF造血祖细胞适应度和炎症微环境。
- 主要证据
- 在MPN细胞系和MF患者CD34+细胞中，联合方案比单药更有效抑制增殖和集落形成；在ruxolitinib耐药细胞中selinexor保持活性；多组学分析显示p53核滞留增加和NF-κB/JAK/STAT通路抑制；联合方案减少MF PBMC分泌TNFα、IL-6和MCP-1。
- 研究意义
- 该研究提供证据表明selinexor联合ruxolitinib可调节驱动MF HPC适应度的关键内在和外在因素，可能作为MF的潜在疾病修饰策略，并支持临床研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原代细胞集落形成实验
评估selinexor和ruxolitinib对MF患者和正常供者CD34+细胞克隆形成的影响。
使用MF患者和正常供者CD34+细胞，在selinexor（50-200 nM）±ruxolitinib（50 nM）存在下进行集落形成实验，计数造血集落。
细胞周期和凋亡分析
研究selinexor±ruxolitinib对细胞周期和凋亡的影响。
UKE1和ELF-153细胞处理selinexor（250 nM）±ruxolitinib（100 nM）24-72小时，通过qPCR、western blot和流式细胞术检测TP53通路、细胞周期和凋亡标志。
NF-κB和JAK/STAT信号通路分析
评估selinexor和ruxolitinib对NF-κB和JAK/STAT信号通路的影响。
ELF-153、HEL、UKE-1细胞处理selinexor（250 nM）±ruxolitinib（100 nM）24小时，通过western blot和亚细胞分级检测XPO1、p53、NF-κB和JAK/STAT蛋白。
NF-κB转录活性和细胞因子分泌检测
研究联合方案对NF-κB转录活性和炎症细胞因子分泌的影响。
ELF-153和UKE-1细胞用TNFα刺激，检测NF-κB转录活性；THP-1巨噬细胞和MF患者PBMC处理药物后，检测TNFα、IL-6、MCP-1分泌。
蛋白质组学和RNA-seq分析
全局和亚细胞水平解析selinexor诱导的蛋白质组变化及ruxolitinib耐药机制。
对HEL和ELF-153细胞进行全细胞和核亚细胞蛋白质组学分析；对ruxolitinib耐药HEL细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路。
ruxolitinib耐药细胞模型建立和验证
研究获得性ruxolitinib耐药机制并评估联合方案在耐药细胞中的效果。
通过逐步增加ruxolitinib浓度6周诱导HEL耐药细胞，验证IC50增加>15倍，检测selinexor单药和联合效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Selinexor | Karyopharm Therapeutics | -- |
| Ruxolitinib | Selleckchem | S1378 | |
| Momelotinib | Selleckchem | S2219 | |
| Pacritinib | Selleckchem | S8057 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Glutamax | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo®检测 | Promega | -- |
| 流式分析 | Attune Nxt声聚焦流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
| 细胞因子检测 | HCYTA-60K-7plex | MilliporeSigma | -- |
| TNFα刺激 | 肿瘤坏死因子α | PeproTech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力与联合效应评估 | 细胞系来源和培养条件（HEL、UKE-1、ELF-153、Marimo）、药物浓度范围、处理时间72小时、检测方法CellTiter-Glo® 阅读提示：Methods 'Cell lines utilized'和'Compounds'，Table 1 |
| 原代细胞集落形成实验 | MF患者和正常供者CD34+细胞来源和数量（各5例）、selinexor浓度50-200 nM、ruxolitinib 50 nM、集落计数方法 阅读提示：Results 'Selinexor reduces colony formation...'，Figure 1，Table S2和S3 |
| 细胞周期和凋亡分析 | 细胞系UKE1和ELF-153、药物浓度（selinexor 250 nM，ruxolitinib 100 nM）、处理时间24-72小时、检测方法（qPCR、western blot、流式） 阅读提示：Results 'Selinexor, alone and in combination...'，Figure 2和S1 |
| NF-κB和JAK/STAT信号通路分析 | 细胞系ELF-153、HEL、UKE-1、药物浓度、处理时间24小时、western blot抗体和亚细胞分级方法 阅读提示：Results 'Selinexor and ruxolitinib negatively impact...'，Figure 3和S2 |
| ruxolitinib耐药细胞模型建立 | 耐药诱导方法（逐步增加浓度6周）、耐药标准（IC50增加>15倍）、验证方法 阅读提示：Methods 'Cell lines utilized'，Results 'Selinexor and ruxolitinib in combination...' |