构建Csf1r单倍剂量不足CLL小鼠模型
在生理相关背景下研究Csf1r表达水平对CLL进展的影响
将Csf1r+/−小鼠与Eμ-TCL1转基因小鼠杂交，获得TCL1tg/wtCsf1r+/+和TCL1tg/wtCsf1r+/−队列，进行生存监测和血液分析
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髓系细胞中集落刺激因子1受体表达降低对慢性淋巴细胞白血病进展影响有限
Reduced colony-stimulating factor 1 receptor expression in myeloid cells has limited impact on chronic lymphocytic leukaemia progression
实验完整度
高包含Eμ-TCL1转基因小鼠体内模型、患者原代CLL细胞体外共培养、CRISPR-Cas9敲除及RNA测序，具功能与机制验证
主要模型
Eμ-TCL1转基因CLL小鼠与Csf1r+/−小鼠杂交队列 MacCsf1r+/+与MacCsf1r−/−小鼠巨噬细胞系 THP-1 Scr与THP-1 CSF1R−/−人巨噬细胞 患者来源原代CLL细胞
重点核对
TCL1tg/wtCsf1r+/+与TCL1tg/wtCsf1r+/−小鼠在8月龄外周血CLL细胞百分比 MacCsf1r+/+与MacCsf1r−/−巨噬细胞共培养时患者CLL细胞存活率（Annexin V/7-AAD） THP-1 Scr与THP-1 CSF1R−/−巨噬细胞共培养时患者CLL细胞存活率 患者CLL细胞向巨噬细胞迁移的流式检测 CSF1R−/−巨噬细胞转录组差异表达基因及GO/GSEA分析
摘要
靶向集落刺激因子1受体（CSF1R）以清除肿瘤相关巨噬细胞正被探索作为癌症治疗策略。该策略可能与慢性淋巴细胞白血病（CLL）相关，因为CLL强烈依赖髓系细胞的支持。然而，CSF1R表达如何影响CLL微环境和白血病进展尚不清楚。为探讨这一问题，我们构建了具有Csf1r单倍剂量不足的Eμ-TCL1转基因CLL小鼠，以研究髓系细胞变化、Csf1r表达和白血病进展。Csf1r单倍剂量不足降低了循环单核细胞上的Csf1r表达，但未显著损害组织巨噬细胞中的表达，也未改变血液和淋巴组织中单核细胞或巨噬细胞的总体数量。Csf1r水平较低的Eμ-TCL1转基因小鼠在疾病早期白血病较少，但该效应随疾病进展而消退，其总体生存期与对照组相似。此外，体外共培养表明，细胞系上CSF1R表达的缺失不影响患者来源CLL细胞的存活或迁移。总之，我们的结果表明，尽管CSF1R通路对维持支持CLL的髓系细胞很重要，但单纯降低CSF1R表达对疾病进展影响有限。针对CSF1R的白血病治疗尝试可能受益于更强的巨噬细胞清除或与其他药物联用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 降低髓系细胞中CSF1R表达水平是否影响慢性淋巴细胞白血病的微环境及白血病进展？
- 核心机制
- Csf1r单倍剂量不足仅降低循环单核细胞的Csf1r表达，组织巨噬细胞表达未显著改变；CSF1R缺失的巨噬细胞出现炎症及增殖相关转录改变，但仍保留支持CLL细胞存活和募集的能力。
- 主要证据
- TCL1tg/wtCsf1r+/−小鼠8月龄外周血CLL负荷显著降低，但组织浸润和总体生存期无差异；患者CLL细胞与MacCsf1r−/−及THP-1 CSF1R−/−巨噬细胞共培养显示存活和迁移不受影响；转录组分析显示CSF1R缺失引起炎症和增殖相关通路改变。
- 研究意义
- 提示靶向CSF1R治疗CLL的疗效可能更多依赖髓系细胞清除而非单纯降低受体表达水平，未来策略或需更强巨噬细胞清除或联合其他药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估髓系细胞数量和Csf1r表达
验证Csf1r单倍剂量不足对髓系细胞区室和受体表达的影响
通过流式细胞术纵向分析外周血CD11b+单核细胞、脾和骨髓髓系细胞频率，检测CD45+CD11b+细胞的Csf1r表达MFI；免疫组化检测脾CD68+巨噬细胞
评估CLL负荷和组织浸润
确定Csf1r单倍剂量不足是否改变白血病进展
纵向流式检测外周血CD45+CD19+CD5+ CLL细胞，计算绝对数量；检测脾和肝重量、脾和骨髓CLL浸润、脾CD45R+免疫组化；Ki-67染色检测增殖
体外共培养验证CSF1R缺失巨噬细胞的支持功能
验证CSF1R缺失是否影响巨噬细胞对CLL细胞存活和迁移的支持
将患者来源CLL细胞与MacCsf1r+/+、MacCsf1r−/−或THP-1 Scr、THP-1 CSF1R−/−巨噬细胞共培养，检测CLL细胞存活（Annexin V/7-AAD）和迁移
转录组分析CSF1R缺失巨噬细胞的分子变化
探究CSF1R缺失对巨噬细胞转录谱的影响
对THP-1 Scr、THP-1 CSF1R−/−、MacCsf1r+/+和MacCsf1r−/−细胞进行3'端mRNA测序，差异表达分析、GO和GSEA分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
基因编辑与建模
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血液采集 | EDTA包被微量采血管 | Sarstedt | -- |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | BioLegend | -- | |
| THP-1单核细胞系 | DSMZ | ACC16 | |
| CRISPR/Cas9敲除 | Cas9-eGFP慢病毒载体 | Thermo Fisher | -- |
| 靶向人CSF1R的gRNA-1 | Thermo Fisher | CAACGCTACCTTCCAAAACA | |
| 靶向人CSF1R的gRNA-2 | Thermo Fisher | GAACGTGCTAGCACAGGAGG | |
| 靶向人CSF1R的gRNA-3 | Thermo Fisher | AACGGTGACCTTGCGATGTG | |
| 靶向人CSF1R的gRNA-4 | Thermo Fisher | GGACACTGGGCTCTATCACT | |
| 对照gRNA | Invitrogen LentiArray™ | GTACGTCGGTATAACTCCTC | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Carl Roth | -- |
| 脂质体制备 | 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | -- | -- |
| 胆固醇 | -- | -- | |
| DSPE-PEG(2000)-氨基 | -- | -- | |
| 盐酸多柔比星 | -- | -- | |
| THP-1分化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 流式分析 | Annexin V抗体 | BioLegend | -- |
| MACSQuant X流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA测序 | NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- |
| Illumina TruSeq链特异性NEB建库方案 | New England Biolabs | -- | |
| 血液分析 | XE-5000血液分析仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与分组 | Csf1r+/−小鼠遗传背景（C57BL6J x C3Heb/FeJ）、Eμ-TCL1转基因小鼠背景（C57BL/6J）、杂交后代基因型分组、饲养于无病原体设施 阅读提示：Methods 'Mouse experiments'小节及Results中TCL1tg/wtCsf1r+/+与TCL1tg/wtCsf1r+/−命名 |
| 外周血CLL负荷纵向分析 | 采血时间点（2、4、6、8、10、12月龄）、CLL细胞标记（CD45+CD19+CD5+）、流式检测MFI归一化方式、样本量（n=36与n=34） 阅读提示：Methods 'Mouse experiments'、Results 'Loss of one Csf1r allele...'及Figure 3A-C图注 |
| 体外共培养与存活/迁移检测 | 巨噬细胞与CLL细胞接种比例（1×10^5:5×10^5）、GM-CSF浓度（200 ng/mL）、PMA分化浓度（100 ng/mL）与时间（48h）、Annexin V/7-AAD染色、迁移实验技术三重复 阅读提示：Methods 'CLL co-culture and viability assays'小节及Figure 5图注 |
| CRISPR/Cas9敲除THP-1 CSF1R | 慢病毒转导MOI（5和10）、离心条件（800 rpm, 120 min/90 min, 37°C）、gRNA序列、嘌呤霉素筛选浓度（0.75 μg/mL）与时间（>7天） 阅读提示：Methods 'Generation of CSF1R knockout THP-1 cells via CRISPR/Cas 9'小节及Figure 5C、Figure S2 |
| RNA测序与转录组分析 | THP-1分化条件（100 ng/mL PMA, 48h）、每重复细胞数（1×10^6）、生物学三重复、MacCsf1r培养基GM-CSF浓度（10 ng/mL）、测序平台及分析流程（nf-core rnaseq、DESeq2、clusterProfiler） 阅读提示：Methods 'Next-generation messenger ribonucleic acid (mRNA) sequencing'小节及Figure 6、Figure S3图注 |