临床样本中DHX15与AE/AE9a表达及预后分析
验证DHX15在AE+ AML中的表达模式及其与AE9a和预后的关系。
检测169例AE+和114例AE- AML样本中DHX15表达，并对28例有临床特征的AE+样本按DHX15中位表达分组进行Kaplan-Meier生存分析；在AE+样本中分析DHX15与AE、AE9a的相关性。
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DHX15与HNRNPL、RBM33共同影响AML1-ETO阳性急性髓系白血病中AML1-ETO9a的剪接
DHX15 affects AML1-ETO9a splicing together with HNRNPL, RBM33 in AML1-ETO-positive acute myeloid leukaemia
实验完整度
高含169例AE+患者样本、Kasumi-1/SKNO-1细胞、CDX小鼠模型及RIP、RNA pull-down等功能与机制验证。
主要模型
AE+ AML患者骨髓样本（n=169） Kasumi-1细胞系 SKNO-1细胞系 Kasumi-1-LUC CDX NCG小鼠模型
重点核对
AE+ AML患者样本量169例，按DHX15中位表达分为高（n=11）低（n=17）两组 DHX15敲低和过表达在Kasumi-1和SKNO-1细胞中于病毒感染后48 h或72 h检测增殖和细胞周期 Kasumi-1-LUC CDX模型皮下注射1.2×10^6细胞至6周龄雌性NCG小鼠，n=8 RNA pull-down使用AE、AE9a-short和AE9a体外转录本，结合LC-MS/MS鉴定结合蛋白 RIP使用DHX15或IgG抗体，RT-qPCR检测AE和AE9a，以U1归一化
摘要
AML1-ETO（AE）融合基因由t(8;21)(q22;q22)产生，是急性髓系白血病（AML）的常见亚型。ETO（RUNX1 Partner Transcriptional Co-Repressor 1，又称RUNX1T1）基因第8外显子和第9外显子之间保留外显子9a会产生致癌性AML1-ETO9a（AE9a）剪接变体。本研究揭示了RNA解旋酶DHX15（DEAH-box helicase 15）可能参与AE9a剪接及AML进展。临床上，DHX15高表达与AE阳性（AE+）AML患者中AE9a/AE丰度增加及不良预后相关。敲低DHX15在体外损害细胞增殖、诱导S/G2细胞周期阻滞，并在体内延长AE+白血病荷瘤小鼠的总生存期。此外，敲低DHX15降低AE和AE9a表达，RNA免疫沉淀显示DHX15结合AE和AE9a转录本，RNA pull-down实验显示HNRNPL和RBM33与AE9a转录本选择性相互作用。三维结构预测提示DHX15、HNRNPL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L）和RBM33（RNA binding motif protein 33）可能形成复杂的调控复合物。进一步，HNRNPL和RBM33基因表达与AE+ AML样本中AE9a水平正相关。下调HNRNPL和RBM33降低Kasumi-1细胞中AE9a表达。总之，我们的发现支持DHX15、HNRNPL、RBM33与AE9a剪接之间的关联，并提示它们参与AE+ AML的白血病进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DHX15是否参与AE+ AML中AE9a剪接调控，并与HNRNPL、RBM33共同影响AE9a表达和白血病进展。
- 核心机制
- DHX15可能与AE及AE9a转录本间接结合，并与HNRNPL、RBM33形成潜在RNA加工网络，影响AE9a剪接模式；三维结构预测提示DHX15、HNRNPL和RBM33存在空间相互作用。
- 主要证据
- 169例AE+ AML样本中DHX15与AE9a正相关；DHX15敲低降低AE/AE9a并诱导S/G2阻滞；CDX模型中DHX15敲低抑制肿瘤生长并延长生存；RIP显示DHX15结合AE/AE9a转录本；RNA pull-down联合LC-MS/MS鉴定HNRNPL和RBM33与AE9a转录本选择性结合。
- 研究意义
- 研究提示DHX15、HNRNPL和RBM33与AE+ AML中AE9a剪接相关，DHX15相关通路可能成为未来治疗探索的潜在方向，但仍需进一步机制验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DHX15敲低和恢复对AE+ AML细胞增殖与细胞周期的影响
验证DHX15对AE+ AML细胞增殖和细胞周期的作用。
在Kasumi-1和SKNO-1细胞中感染DHX15-NC/KD/OE或R-KD慢病毒，采用CCK-8检测增殖，流式细胞术PI染色检测细胞周期，Western blot检测细胞周期相关蛋白。
DHX15敲低对AE+ AML CDX模型体内肿瘤生长和生存的影响
验证DHX15在体内对AE+白血病进展和生存的作用。
建立Kasumi-1-LUC CDX NCG小鼠模型，比较NC和DHX15-KD组肿瘤生长、生物发光强度和总生存期。
DHX15与AE/AE9a转录本结合的验证
验证DHX15是否结合AE和AE9a转录本。
在Kasumi-1细胞中进行RIP，使用DHX15抗体或IgG对照沉淀，RT-qPCR检测AE和AE9a；并进行RNA pull-down使用AE、AE9a-short和AE9a体外转录本，结合Western blot和LC-MS/MS检测结合蛋白。
HNRNPL和RBM33与AE9a相关性及功能验证
验证HNRNPL和RBM33与AE9a表达的关系及其对AE9a生成的影响。
在69例AE+ AML样本中分析AE9a/AE与HNRNPL、RBM33、SRSF4、SF3A2的相关性；在Kasumi-1细胞中敲低HNRNPL和RBM33，RT-qPCR检测DHX15、RBM33、HNRNPL、AE和AE9a表达；利用ColabFold预测DHX15-HNRNPL-RBM33三维结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | E.Z.N.A.®总RNA提取试剂盒I | OMEGA | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| cDNA合成 | Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific™ | -- |
| RT-qPCR | QuantStudioTM实时PCR系统 | ABI | QuantStudio 6 Flex |
| FastStart通用SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone | SH30809.01B |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141-FBS | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 300-03 | |
| DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01B | |
| Western blot | DHX15抗体 | Proteintech | 12265-1-AP |
| AML1抗体 | CST | 4336T | |
| P53抗体 | CST | 9282S | |
| 磷酸化p53抗体 | CST | 9286S | |
| p21抗体 | CST | 2947S | |
| 磷酸化AKT抗体 | CST | 4060S | |
| AKT抗体 | CST | 4685S | |
| c-myc抗体 | CST | 5605S | |
| Cyclin D1抗体 | CST | 2978S | |
| Cyclin E2抗体 | CST | 4132S | |
| Cyclin A2抗体 | CST | 4656T | |
| ATM抗体 | Abcam | ab32420 | |
| 磷酸化CDC2抗体 | CST | 4539T | |
| MYT1抗体 | CST | 4282T | |
| CHK2抗体 | Abcam | ab32148 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5147S | |
| 细胞周期分析 | BD流式细胞术DNA染色方案 | BD Biosciences | 550825 |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒 | Kumamoto | -- |
| CDX模型构建 | pLVX-Puro-Luc荧光素酶报告载体 | Miaolingbio | P18849 |
| RNA-seq | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP™试剂盒 | Millipore | 17-701 |
| RNA pull-down | Pierce™磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20164 |
| Western blot | 蛋白分子量标准 | ThermoFisher | 26616 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | AE+ AML样本来源和数量（福建协和医院n=85，其他医院n=84，总计169）、AE-样本n=114、生存分析样本n=28及分组依据 阅读提示：Patient samples小节及Figure 1A–B图注；Table S3 |
| 细胞增殖和细胞周期检测 | 细胞系Kasumi-1和SKNO-1、慢病毒感染后检测时间（48 h或72 h）、CCK-8三重复、流式PI染色三重复 阅读提示：Cell cycle and proliferation小节及Figure 1C–D、Figure 2C图注 |
| CDX模型体内实验 | NCG小鼠6周龄雌性、皮下注射1.2×10^6 Kasumi-1-LUC细胞、每组n=8、肿瘤体积每3天监测、IVIS每7天检测、生存终点1.5 cm³ 阅读提示：CDX model and in vivo imaging system assay小节及Figure 1E–G图注 |
| RIP结合验证 | Kasumi-1细胞、DHX15抗体或IgG对照、Magna RIP™ Kit（#17-701）、RT-qPCR以U1归一化、三重复 阅读提示：RNA immunoprecipitation小节及Figure 4C图注 |
| RNA pull-down和质谱鉴定 | AE、AE9a-short和AE9a体外转录本、Pierce™ Magnetic RNA-Protein pull-down kit（#20164）、LC-MS/MS数据、蛋白结合结果 阅读提示：RNA pull-down assay小节及Figure 4D–F图注；Data S1 |
| HNRNPL/RBM33敲低功能验证 | Kasumi-1细胞、HNRNPL和RBM33敲低序列（Table S2）、RT-qPCR检测DHX15、RBM33、HNRNPL、AE和AE9a、三重复 阅读提示：RNA interference and restoration小节及Figure 5C,C'图注；Table S2 |