建立CLL-PDLS三维培养模型
建立能保留B-T细胞相互作用的三维培养体系。
将CLL或RT患者PBMC在超低吸附板中培养，形成圆盘状球体，并在不同刺激条件下优化培养。
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慢性淋巴细胞白血病无支架三维培养保留B-T细胞串扰并实现药物反应分析
Scaffold-free three-dimensional culture of chronic lymphocytic leukaemia preserves B-T-cell cross-talk and enables drug response profiling
实验完整度
高体外3D培养模型结合患者原代样本，包括细胞活力、增殖、表型和药物反应功能验证，含流式细胞术、活细胞成像和多种刺激条件。
主要模型
CLL患者来源PBMC形成的3D淋巴瘤球体（CLL-PDLS） CLL患者原代肿瘤B细胞和自体T细胞 RT患者来源PBMC形成的3D球体 HS-5骨髓基质细胞系
重点核对
ODN 0.2 μM + IL-15 15 ng/mL刺激下3D培养6天的肿瘤B细胞活力约82.7%，T细胞活力约67.2% 细胞接种密度50,000 cells/mL维持肿瘤活力68%，高于25,000 cells/mL的53% venetoclax 25 nM、50 nM、75 nM处理72小时，CLL敏感样本活力降至平均37%，RT样本无显著反应 ibrutinib 1 μM处理6天，CLL样本增殖降至37.7%±1.6%（2D）和33.7%±1.7%（3D），RT样本维持高增殖 αCD3/αCD28 Dynabeads与ODN+IL-15联合刺激显著增加T细胞增殖（95.9%±1.4%），B/T比例维持约90%/10%
摘要
慢性淋巴细胞白血病（CLL）呈现复杂的生物学和临床图景，受肿瘤微环境（TME）强烈影响。为更好地捕捉这种异质性，我们开发了来源于CLL样本的患者来源淋巴瘤球体（CLL-PDLS），其重现恶性细胞与自体免疫微环境之间的串扰，从而为后续研究实现高效药物筛选。CLL球体将肿瘤B细胞与自体T细胞整合在一起，这些细胞自组织成三维（3D）圆盘状结构。培养物在最佳条件下可维持长达6天，保持细胞活力和高增殖活性。T细胞在CD4+和CD8+亚群中表现出多种活化和耗竭表型，包括程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、CD25、T细胞免疫受体与Ig和ITIM结构域（TIGIT）及CD69的表达。细胞组成保持稳定，肿瘤B细胞约占群体的90%，T细胞占10%。该模型通过评估对常规疗法的反应得到进一步验证，包括ibrutinib和venetoclax。总之，该3D球体模型捕捉了CLL中B-T相互作用的关键功能方面，维持恶性B细胞与其自体免疫组分之间的动态相互作用，部分重现微环境特征，并为临床前治疗评估提供了有前景的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立保留CLL中恶性B细胞与自体T细胞相互作用的三维培养模型，并用于药物反应分析。
- 核心机制
- 自体T细胞与肿瘤B细胞在3D球体中相互作用，维持B/T比例；TLR9激动剂ODN加IL-15促进肿瘤B细胞增殖和存活，αCD3/αCD28刺激驱动T细胞活化并上调PD-1、LAG3等耗竭标志物。
- 主要证据
- 患者来源PBMC在ULA板中形成3D球体，流式细胞术显示ODN+IL-15维持B细胞活力88.6%、增殖90.9%，3D培养肿瘤B细胞活力高于2D（82.7% vs 65.7%），活细胞成像显示球体形成和CFSE稀释，T细胞表达PD-1、CD25、TIGIT和CD69。
- 研究意义
- 该无支架3D球体模型捕捉CLL中B-T相互作用的关键功能特征，部分重现微环境，为研究CLL生物学、免疫相互作用和临床前药物反应提供可操作平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化B细胞和T细胞刺激条件
确定维持肿瘤B细胞活力和增殖的最佳刺激组合。
比较CD40L+IL-4与ODN+IL-15对B细胞和T细胞活力及增殖的影响，并测试不同细胞接种密度。
比较2D与3D培养对细胞活力和增殖的影响
验证3D培养是否优于传统2D培养。
在ODN+IL-15刺激下，比较3D球体与2D圆底96孔板培养中肿瘤B细胞和T细胞的活力与增殖。
评估自体T细胞对球体动态的影响
确定T细胞刺激对B/T比例和球体结构的影响。
在ODN+IL-15基础上加入αCD3/αCD28 Dynabeads±IL-2，分析B细胞、CD4+和CD8+ T细胞比例、活力和增殖。
表征T细胞活化和耗竭表型
分析3D模型中T细胞的活化和耗竭标志物表达。
在培养第3天和第7天通过流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞表面CD69、CD25、HLA-DR、CD137、PD-1、LAG3、TIM3、CD244等标志物。
药物反应分析
验证模型对venetoclax和ibrutinib的药物反应。
在ODN+IL-15+αCD3/αCD28刺激下，用venetoclax（25、50、75 nM）处理72小时或ibrutinib（1 μM）处理6天，通过流式细胞术和CFSE检测细胞活力和增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基（含GlutaMAX） | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| B细胞刺激 | CpG-ODN 2006-TLR9 | InvivoGen | -- |
| 人IL-15 | R&D Systems | -- | |
| T细胞刺激 | 重组人CD40配体 | R&D Systems | -- |
| 人IL-4 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD3/抗CD28 Dynabeads | Gibco | -- | |
| 重组人IL-2 | PeproTech | -- | |
| 流式分析 | Annexin-V（Pacific Blue） | Invitrogen | -- |
| LSRFortessa™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSDiva v8软件 | BD Biosciences | -- | |
| 增殖分析 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE） | Life Technologies | -- |
| 活细胞成像 | Cytation1自动数字显微镜 | Biotek | -- |
| Gen 5软件 | Biotek | -- | |
| HS-5追踪 | 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 药物处理 | venetoclax | -- | -- |
| ibrutinib | -- | -- | |
| 统计分析 | Prism v8.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CLL-PDLS生成 | PBMC来源和肿瘤B细胞纯度≥80% CD19+/CD5+；细胞接种密度50,000 cells/mL；ODN 0.2 μM + IL-15 15 ng/mL；培养6天，37°C，5% CO2；超低吸附板。 阅读提示：Methods中CLL-patient-derived lymphoma spheroids (PDLS) generation小节及Figure 1A。 |
| T细胞刺激 | αCD3/αCD28 Dynabeads与T细胞比例1:1；IL-2 50 U/mL；刺激时间6天；对照条件为无刺激或仅ODN+IL-15。 阅读提示：Methods中CLL-patient-derived lymphoma spheroids (PDLS) generation小节及Figure 4。 |
| 药物处理 | venetoclax浓度25、50、75 nM，处理72小时；ibrutinib浓度1 μM，处理6天；药物处理在培养第3天开始；对照为无药物。 阅读提示：Methods中Drug assay小节及Figure 6 legend。 |
| 流式细胞术检测 | Annexin-V和CFSE标记；抗体信息和设门策略见Table S2和Figure S1；样本获取于LSRFortessa。 阅读提示：Methods中CLL-PDLS viability, proliferation and imaging小节及Supplementary Figure S1、Table S2。 |
| 统计分析 | Friedman检验 followed by one-way ANOVA with Tukey's test；显著性水平p<0.05；样本未排除。 阅读提示：Methods中Statistical analysis小节。 |