The Interplay of M1 Macrophages and Dental Pulp Stem Cells Promotes Angiogenesis Through IL-8-Dependent VEGF Regulation: An In Vitro Study
包含体外细胞模型、芯片血管系统、分子机制验证（RNA-seq、Western blot）及抑制剂功能验证，涉及多个独立证据层级。
THP-1来源巨噬细胞（M0/M1/M2极化） 人外周血单核细胞（PBM）来源巨噬细胞（M1/M2极化） 牙髓干细胞（DPSCs） 人脐静脉内皮细胞（HUVECs/GFP-HUVECs）
M1巨噬细胞接种密度：5×10^4 vs 7.5×10^4 cells/device IL-8抑制剂Reparaxin使用浓度：1 μM 外源性IL-8使用浓度：0.5 ng/mL ERK抑制剂SCH772984使用浓度：25 nM 巨噬细胞极化刺激因子浓度：PMA 320 nM、IL-4 40 ng/mL、IL-13 20 ng/mL、LPS 100 ng/mL、IFN-γ 100 ng/mL
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立并验证M0、M1、M2巨噬细胞模型，确认其表型和分泌特征。
THP-1细胞经PMA（320 nM，24h）分化为M0，再经LPS（100 ng/mL）+ IFN-γ（100 ng/mL）或IL-4（40 ng/mL）+ IL-13（20 ng/mL）诱导为M1或M2。PBM经M-CSF（20 ng/mL，7天）分化为M0，再以相同细胞因子极化。通过qRT-PCR检测IL-8、IL-12、TNF-α、CD163、CCL22、FN-1等基因，ELISA检测TNF-α，血管生成阵列分析分泌组。
研究不同巨噬细胞表型对DPSC支持的血管管形成的影响。
在微流控装置中，中央通道加载DPSCs和GFP-HUVECs（1:5）混合的纤维蛋白水凝胶（2.5 mg/mL，含Aprotinin和thrombin），侧通道在第3天接种M0、M1或M2巨噬细胞（5×10^4 cells/device）。每日荧光成像，定量血管段和游离芽。
探究M1巨噬细胞密度对其促血管生成效应的影响及细胞毒性。
M1巨噬细胞以5×10^4或7.5×10^4 cells/device接种于芯片侧通道，观察第4天和第5天血管参数。第5天用碘化丙啶染色评估细胞死亡。
验证M1巨噬细胞分泌的IL-8是否通过CXCR1/2诱导DPSC分泌VEGF。
用THP-1或PBM来源的巨噬细胞CM（24h或48h）处理DPSCs 48h，含或不含IL-8抑制剂Reparaxin（1 μM）。ELISA检测DPSC上清中VEGF浓度。另用外源性IL-8（0.1–5 ng/mL）处理DPSCs 48h，ELISA和qRT-PCR检测VEGF。
评估IL-8诱导的DPSC VEGF分泌对内皮管形成的影响。
将HUVECs（1×10^4）接种于Matrigel上，分别用巨噬细胞CM、巨噬细胞CM处理的DPSC上清（含或不含Reparaxin）、外源性IL-8处理的DPSC上清重悬。在4、6、8、12h监测，8h定量血管段和网。
分析M1巨噬细胞共培养对DPSC基因表达的影响，鉴定候选枢纽基因和信号通路。
DPSCs（2×10^5 cells/insert）接种于Transwell上室，PBM来源M1或M2巨噬细胞（1×10^5 cells/well）接种于下室，共培养48h。收集DPSCs RNA进行链特异性RNA测序，每组3个生物学重复。进行差异表达分析和KEGG富集。
验证IL-8通过MAPK/ERK通路调控HIF-1α，进而影响VEGF分泌。
DPSCs血清饥饿24h后，用M1 CM（24h）或IL-8（0.5 ng/mL）处理3h，含或不含Reparaxin和ERK抑制剂SCH772984（25 nM）。Western blot检测p-ERK、总ERK、HIF-1α，以α-Tubulin或GAPDH为内参。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-最低必需培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | -- | |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | -- | |
| 罗斯威尔公园纪念研究所1640培养基 | ThermoFisher | -- | |
| 巨噬细胞极化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 重组人IL-4 | R&D Systems | -- | |
| 重组人IL-13 | Thermofisher | -- | |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 干扰素-γ | R&D Systems | -- | |
| 单核细胞分离 | 经典单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 巨噬细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | ELISA开发试剂盒 | R&D Systems | -- |
| IL-8抑制 | Reparaxin | MedChemexpress | DF 1681Y |
| IL-8处理 | 重组人IL-8 | Sigma-Aldrich | -- |
| 芯片血管系统 | 微流控装置 | AIM Biotech | -- |
| 纤维蛋白水凝胶 | -- | -- | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 凝血酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Matrigel实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 15孔3D μ载玻片—81 506 | Ibidi | 81 506 | |
| RNA提取 | Trizol | Invitrogen | -- |
| 天根DP762-T1C试剂盒 | Tiangen Biotech | DP762-T1C | |
| HieffNGS DNA选择磁珠 | Yeasen | -- | |
| qRT-PCR | cDNA逆转录试剂盒 | Takara Bio | -- |
| Fast SYBR Green预混液 | Takara | -- | |
| Western blot | M-PER蛋白提取缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Vazyme | -- | |
| BCA试剂盒 | Vazyme | -- | |
| PVDF膜 | Vazyme | -- | |
| 小鼠单克隆HIF-1α抗体 | Abcam | -- | |
| 小鼠单克隆抗αTubulin抗体 | Abcam | -- | |
| 兔单克隆抗p-ERK42/44抗体 | Cell signalling Technology | -- | |
| 兔单克隆抗ERK42/44抗体 | Cell signalling | -- | |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 剥离缓冲液 | Abcam | -- | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Westernbright增强化学发光试剂 | Advansta Inc. | -- | |
| ERK抑制 | SCH772984 | Medchemexpress | HY-50846 |
| 显微镜成像 | Nikon TI-SFL显微镜 | Nikon | -- |
| Nikon DS Ri1显微镜 | Nikon | -- | |
| 凝胶成像 | 凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- |
| RNA质控 | NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | -- |
| Nanodrop2000 | -- | -- | |
| Agilent2100 | -- | -- | |
| LabChip GX | -- | -- | |
| 文库质控 | Qsep-400系统 | -- | -- |
| 细胞培养 | 牙髓干细胞 | Lonza | -- |
| 人脐静脉内皮细胞 | ScienCell | -- | |
| 绿色荧光蛋白标记人脐静脉内皮细胞 | Angio-Proteomie | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞极化 | THP-1细胞：PMA 320 nM 24h分化M0；M1诱导LPS 100 ng/mL + IFN-γ 100 ng/mL 48h；M2诱导IL-4 40 ng/mL + IL-13 20 ng/mL 48h。PBM：M-CSF 20 ng/mL 7天；第5天添加极化因子。 阅读提示：Methods 2.4和2.5节，Figure 2A和2B |
| 芯片血管系统 | DPSCs与GFP-HUVECs比例1:5，纤维蛋白水凝胶2.5 mg/mL，巨噬细胞接种密度5×10^4或7.5×10^4 cells/device，每组3个装置，观察至第5天。 阅读提示：Methods 2.9节，Figure 3A和4A-B |
| IL-8调控VEGF分泌 | 巨噬细胞CM处理DPSCs 48h，Reparaxin 1 μM，外源性IL-8浓度0.1–5 ng/mL（最佳0.5 ng/mL），ELISA检测VEGF。 阅读提示：Methods 2.8节，Figure 5A(iii)和5D(iii)，Figure S2A |
| Matrigel管形成实验 | HUVECs 1×10^4 cells/孔，Matrigel 10 μL，定量时间点8h，独立重复三次。 阅读提示：Methods 2.10节，Figure 5C，Figure S2C-D |
| Western blot信号通路验证 | DPSCs血清饥饿24h（0.2% FBS），M1 CM或IL-8（0.5 ng/mL）处理3h，Reparaxin 1 μM，SCH772984 25 nM，检测p-ERK、HIF-1α，每组3个生物学重复。 阅读提示：Methods 2.14和2.15节，Figure 6D和6E |
