出生后心脏时空图谱构建
在空间和时间维度上解析出生后心脏发育的细胞组成和转录程序
对P0、P7、P14、P21四个时间点的小鼠心脏进行snRNA-seq和Xenium空间转录组测序，并使用CytoSPACE整合两种数据
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出生后心脏的空间引导体内单细胞功能基因组学
Spatially guided in vivo single-cell functional genomics of postnatal heart
实验完整度
高包含snRNA-seq、Xenium空间转录组、PIP-seq体内CRISPR筛选及Rreb1等功能验证，独立证据层级≥2且有多层次功能验证。
主要模型
出生后小鼠心脏组织（P0、P7、P14、P21） AAV9感染的出生后小鼠心肌细胞 离体培养的出生后小鼠心肌细胞 iPSC来源的心肌细胞
重点核对
snRNA-seq和Xenium均收集P0、P7、P14、P21四个时间点，每个时间点两个生物学重复 Xenium多模态细胞分割：DAPI标记细胞核，ATP1A1/CD45/E-cadherin标记细胞边界，18S rRNA标记内部RNA，α-SMA/vimentin标记内部蛋白 PIP-seq中AAV9文库注射剂量为每只新生小鼠4×10^10病毒颗粒，P0注射，P14收获 PIP-seq测序前通过流式分选富集GFP+/DRAQ5+细胞核 Rreb1功能验证：AAV9-sgRreb1高剂量8×10^10病毒颗粒/只，P0注射，P35进行超声心动图检测
摘要
理解空间组织和细胞间相互作用如何塑造基因调控程序是解码组织发育和功能的核心。出生时的转变以循环需求增加和快速组织生长为标志，需要心脏成熟的精确时空协调。在本研究中，我们通过整合单核RNA测序和基于图像的空间转录组学，生成了出生后小鼠心脏的高分辨率空间和时间图谱。该框架揭示了动态细胞相互作用、生态位特异性信号传导和指导心肌细胞成熟的转录程序。为了在体内大规模功能性地测试优先调控因子，我们开发了PIP-seq（基于探针的可检测插入缺失的Perturb-seq），这是一个高通量平台，可从固定细胞核中检测单导RNA身份、推断基因编辑并分析转录。将PIP-seq应用于发育中的出生后心脏，我们识别了21个先前未表征的心肌细胞成熟调控因子，包括对肌节组装、代谢重编程和电生理转变至关重要的基因。总之，我们的发现定义了微环境信号和内在基因程序如何协同指导心脏成熟，并建立了一个适用于复杂组织功能基因组学的广泛框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 出生后心脏发育过程中，细胞如何在空间上组织并通过细胞间相互作用协调心肌细胞成熟？如何高通量地在体内功能性验证心肌细胞成熟的候选调控因子？
- 核心机制
- 微环境信号（如毛细血管内皮细胞与心肌细胞间的PTPRM-PTPRM相互作用）与内在转录程序（如Rreb1-Thra-甲状腺激素响应程序）协同调控心肌细胞成熟；SigNET可将空间配体-受体信号与下游转录因子（如MEIS1、ELK3）联系起来。
- 主要证据
- 通过snRNA-seq和Xenium空间转录组构建出生后心脏高分辨率时空图谱，鉴定12个细胞生态位和空间限制的配体-受体相互作用；开发PIP-seq平台，在体内筛选50个候选调控因子，鉴定21个调控心肌细胞成熟的基因（包括Rreb1、Rad21、Ncl）；对Rreb1进行靶向敲除，发现其导致心肌细胞尺寸减小、T管结构异常、电生理和代谢功能受损以及心脏功能下降。
- 研究意义
- 本研究建立了在天然生理背景下研究基因功能、调控网络和细胞相互作用的严格平台，为剖析组织结构和细胞间通讯如何调控心血管成熟、再生和疾病提供了框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞生态位和细胞间通讯分析
鉴定出生后心脏中的空间生态位并解析配体-受体相互作用网络
使用CellCharter鉴定12个细胞生态位；使用COMMOT分析空间细胞通讯，采用距离惩罚（旁分泌>200μm，近分泌>50μm）
心肌细胞成熟指数构建与空间分析
量化心肌细胞成熟程度并分析其与空间邻近非心肌细胞类型的关系
基于21个成熟相关基因的表达计算成熟指数；分析心肌细胞成熟指数与其到非心肌细胞类型距离的相关性
PIP-seq平台开发与体内筛选
在体内高通量筛选心肌细胞成熟的候选调控因子
使用AAV9递送sgRNA文库，结合固定细胞核转录组分析和探针检测sgRNA及扰动状态
候选调控因子Rreb1的功能验证
验证Rreb1敲除对心肌细胞成熟和心脏功能的影响
通过AAV9-sgRreb1在P0小鼠中敲除Rreb1，在P14评估心肌细胞大小和T管结构，在P35评估电生理、代谢和心脏功能
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | I型胶原蛋白溶液 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗α-actinin小鼠单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | A7811 |
| 抗mPDGFrα抗体 | R&D Systems | AF1062 | |
| CD31/PECAM-1抗体 | R&D Systems | AF3628 | |
| 抗PTPRM抗体 | Abcam | ab231607 | |
| 抗Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-82 | |
| 抗POSTN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398631 | |
| Western blot | 抗RREB1抗体 | Invitrogen | PA5-116933 |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| HRP偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 109-035-045 | |
| Pierce ECL Western Blotting底物 | Thermo Fisher Scientific | 32109 | |
| RNAscope | 多重荧光V2检测 | Advanced Cell Diagnostics | 323110 |
| 蛋白酶III | Advanced Cell Diagnostics | 322337 | |
| TSA Plus Cyanine 3系统 | PerkinElmer | NEL744001KT | |
| TSA Plus Cyanine 5系统 | PerkinElmer | NEL745001KT | |
| 含DAPI的Fluor-Gel II封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| 免疫荧光 | 含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36971 |
| T管成像 | FM4-64 | Invitrogen | 13320 |
| 电生理分析 | FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 |
| Seahorse分析 | Seahorse XFe96/XF Pro细胞培养微孔板 | Agilent Technologies | 103794-100 |
| XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| PIP-seq | Chromium固定RNA单细胞分析试剂盒（单样本） | 10x Genomics | CG000691 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 出生后心脏时空图谱构建 | 时间点：P0、P7、P14、P21；每时间点生物学重复数：2；snRNA-seq质控标准：线粒体基因表达>5%，nFeature>7500或<750；Xenium基因面板包含405个基因 阅读提示：详见Methods中“Single-nucleus RNA-seq of postnatal heart”和“Single-cell spatial transcriptome of postnatal heart”小节 |
| 细胞生态位和通讯分析 | CellCharter聚类数k=12；COMMOT旁分泌最大距离200μm，近分泌最大距离50μm；细胞通讯数据库：CellPhoneDB_v4.0 阅读提示：详见Methods中“Spatial clustering of postnatal heart with CellCharter”和“Cell−cell communication”小节 |
| PIP-seq体内筛选 | AAV9注射剂量：4×10^10病毒颗粒/只；注射时间P0；收获时间P14；MOI=0.3；候选基因50个；sgRNA UMI阈值>3 阅读提示：详见Methods中“PIP-seq”小节和“PIP-seq library preparation” |
| Rreb1功能验证 | AAV9-sgRreb1高剂量8×10^10病毒颗粒/只；注射时间P0；超声心动图检测时间P35；心肌细胞大小测量时间P14；T管检测时间P35 阅读提示：详见Methods中“AAV9 injection and echocardiogram”和“In situ confocal imaging of T-tubule-stained postnatal heart”小节以及Fig. 7图注 |
| 离体心肌细胞功能检测 | 心肌细胞分离自4-5周龄小鼠；Seahorse检测：每孔1000个细胞，oligomycin 1.5μM，FCCP 2μM，rotenone/antimycin A 1μM；电生理检测：场刺激1Hz 阅读提示：详见Methods中“CM isolation and immunocytochemistry”、“Seahorse XF mitochondrial stress test of postnatal CMs”和“Electrophysiology profiling of postnatal CMs”小节 |