全基因组测序鉴定vmp基因盒
确定B. miyamotoi中vmp基因盒的组成和排列
对MYK1克隆G3和M1-2Br克隆H4进行PacBio和Illumina测序，组装基因组，鉴定线性质粒上的vmp基因盒
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗原变异由硬蜱传播的回归热螺旋体Borrelia miyamotoi中的长质粒片段转换引起
Antigenic variation is caused by long plasmid segment conversion in a hard tick-borne relapsing fever Borrelia miyamotoi
实验完整度
高包含体外培养、小鼠感染模型、全基因组测序、长PCR、PFGE、Southern blot、Illumina mapping等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠（C57BL/6J、BALB/cJ、BALB/c-nude、CB17SCID） B. miyamotoi菌株MYK2 A9和MYK4 C8 B. miyamotoi M1-2Br克隆H4
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J、BALB/cJ、BALB/c-nude、CB17SCID；接种剂量2 x 10^5个细菌腹腔注射 表达vmp盒检测：使用引物Vmp-UHR-F和Vmp-DHR-R1/R2进行PCR扩增，TA克隆后测序 长PCR：引物Vmp-UHR-F和Vmp-LR，条件95°C 1 min，40循环95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 5 min PFGE：switch time 0.1–12 s，15 h，6 V/cm Illumina read mapping：表达位点片段被mask，归一化使用指定区域平均深度
摘要
Borrelia miyamotoi是一种硬蜱传播的螺旋体，与回归热螺旋体遗传相关，是引起人类新发传染病的病原体。与回归热螺旋体类似，B. miyamotoi在多个线性质粒上携带编码可变主要蛋白（Vmps）的基因盒簇，并通过切换表达的vmp基因盒在哺乳动物宿主中表现出抗原变异。然而，B. miyamotoi中这种切换如何发生仍不清楚。在此，我们测定了日本B. miyamotoi菌株的全基因组序列，以鉴定五个线性质粒上vmp基因盒的组成和排列，并基于此信息分析了从实验感染小鼠中重新分离的B. miyamotoi克隆。我们的分析揭示，切换是通过用来自存档质粒的长片段替换表达盒及其下游沉默盒而发生的。作为这种长片段转换的结果，第一个盒成为表达盒。值得注意的是，这种现象不是由于单基因转换，而是长（长达16 kb或更多）质粒片段的替换。我们还表明，虽然细菌清除依赖于特定抗体的存在，但片段转换在感染后五天即被检测到，早于小鼠中抗体的产生，甚至在严重联合免疫缺陷小鼠中也能检测到。这些结果为Borrelia进化出的在哺乳动物宿主中生存和持续存在的机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B. miyamotoi如何发生抗原变异（表达vmp盒的切换）？
- 核心机制
- 抗原变异通过长质粒片段转换发生：表达盒及其下游沉默盒被来自存档质粒的长片段（长达16 kb或更多）替换，替换片段上的第一个沉默盒成为新的表达盒。
- 主要证据
- 全基因组测序揭示vmp基因盒在五个线性质粒上的排列；从感染小鼠中重新分离的菌株和直接PCR/TA克隆分析显示表达盒在感染后5天发生剧烈变化；长PCR、PFGE和Illumina read mapping证实表达位点片段被长片段替换。
- 研究意义
- 提供了对Borrelia在哺乳动物宿主中生存和持续存在的机制的新见解，揭示了硬蜱传播回归热螺旋体独特的抗原变异系统。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠感染实验及细菌载量监测
评估B. miyamotoi在 mice中的感染动态
将MYK2 A9和MYK4 C8菌株腹腔注射到B6、BALB/cJ、nude和SCID小鼠，使用qPCR检测血液中细菌载量
从感染小鼠中重新分离B. miyamotoi
获得感染后体内的B. miyamotoi克隆
从感染小鼠的血液或肝脏中接种到BSK-M培养基，培养后克隆稀释，分析表达vmp盒
表达vmp盒的检测与分析
分析感染后表达vmp盒的变化
对重新分离的克隆或直接 from 小鼠样本的DNA进行PCR扩增表达盒，TA克隆后测序，确定表达的vmp盒
长PCR验证长片段转换
验证表达位点片段被长片段替换的假设
使用长PCR扩增从启动子到质粒右端的片段，比较亲本和重新分离菌株的片段大小
PFGE和Southern blot分析
确认质粒大小变化和表达位点片段的替换
对亲本和重新分离菌株进行PFGE，比较质粒大小；Southern blot使用启动子区域探针检测表达位点片段
Illumina read mapping验证片段重复
确认存档质粒片段被复制并替换表达位点片段
将重新分离菌株和亲本的Illumina reads mapping到M1-2Br H4基因组（mask表达位点片段），分析覆盖深度
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全基因组测序 | 基因组DNA提取柱 | QIAGEN | -- |
| PacBio RS II测序系统 | Pacific Biosciences | -- | |
| Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 快速条形码测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RBK004 | |
| MinION测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| qPCR | Premix Ex Taq试剂盒 | Takara Bio | -- |
| LightCycler 480 System II实时PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| Qubit HR试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNA提取 | Wizard基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | -- |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RT-PCR | OneStep RT-PCR试剂盒 | QIAGEN | -- |
| PCR | Tks Gflex DNA聚合酶 | Takara Bio | -- |
| Ex Taq DNA聚合酶 | Takara Bio | -- | |
| TA克隆 | pGEM-T easy载体 | Promega | -- |
| 大肠杆菌DH5a菌株 | TOYOBO | -- | |
| DNA纯化 | AxyPrep MAG PCR纯化试剂盒 | CORNING | -- |
| PFGE | SeaKem Gold琼脂糖 | Lonza | -- |
| CHEF-DRII系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白酶K | Roche Diagnostics | -- | |
| pefabloc SC | Roche Diagnostics | -- | |
| Southern blot | Hybond-N+膜 | Cytiva | -- |
| Alkphos ECL直接标记和检测系统 | GE Healthcare Japan | -- | |
| ECL直接核酸标记系统 | Cytiva | -- | |
| PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 | Takara Bio | -- | |
| Western blot | SuperSep Ace梯度凝胶 | Fujifilm Wako pure chemicals | -- |
| Sequi-Blot PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| Amersham ECL Prime封闭试剂 | Cytiva | -- | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| Amersham ImageQuant 800成像仪 | Cytiva | -- | |
| 细胞培养 | 最小必需培养基α | Bio West | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染实验 | 小鼠品系（C57BL/6J、BALB/cJ、BALB/c-nude、CB17SCID）、接种剂量（2 x 10^5个细菌）、接种途径（腹腔注射）、采样时间点（5、10、15、20、28/30/31 dpi） 阅读提示：Methods中Mouse inoculation experiment小节 |
| 细菌培养 | 培养基（BSK-M）、温度（30°C）、气体条件（微需氧至厌氧）、血清浓度（10%兔血清） 阅读提示：Materials and methods中Borrelia strains and culture media小节 |
| 表达vmp盒检测 | 引物（Vmp-UHR-F、Vmp-DHR-R1/R2）、PCR条件、TA克隆载体（pGEM-T easy） 阅读提示：Materials and methods中Analysis of expression vmp cassettes in isolates小节及S6 Table |
| 长PCR | 引物（Vmp-UHR-F、Vmp-LR）、PCR条件（95°C 1 min，40循环95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 5 min） 阅读提示：Materials and methods中Length estimation of expression locus segments using long PCR小节 |
| Illumina read mapping | 参考基因组（M1-2Br H4，mask lp4 1–11,967 bp）、mapping工具（bwa-mem）、归一化区域 阅读提示：Materials and methods中Mapping of the Illumina reads of the re-isolates and their parental strains to the M1-2Br H4 genome小节 |